Hologic Progensa PCA3 Assay Istruzioni per l'uso
- Tipo
- Istruzioni per l'uso
Progensa PCA3
Progensa PCA3 Assay
Progensa PCA3 Assay 1
501377IT Rev. 003
Per uso diagnostico in vitro.
Solo per esportazione dagli USA.
Informazioni generali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Uso previsto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Sommario e spiegazione della prova . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Principi della procedura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Reagenti e materiali forniti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Materiali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
Avvertenze e precauzioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
Requisiti di conservazione e manipolazione . . . . . . . . . . . . . . . 13
Raccolta, trasporto e conservazione dei campioni . . . . . . . . . . 15
Procedura di analisi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Note procedurali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
Procedure di controllo della qualità . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
Interpretazione dei risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Limiti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Caratteristiche dell’esecuzione del test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
Bibliografia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
Progensa PCA3 Assay 2
501377IT Rev. 003
Informazioni generali Progensa PCA3
Informazioni generali
Uso previsto
Il Progensa PCA3 Assay è una prova di amplificazione dell’acido nucleico (NAAT) in vitro
che rileva l’acido ribonucleico messaggero (RNA) del gene 3 del cancro alla prostata (PCA3)
in campioni di urina maschile per generare un punteggio definito “PCA3 Score”. Il PCA3
Score è concepito per l’uso insieme ad algoritmi diagnostici standard di cura come ausilio
nella diagnosi del cancro alla prostata.
Sommario e spiegazione della prova
L’uso della prova dell’antigene sierico specifico della prostata (PSA) per lo screening del
cancro alla prostata ha portato alla diagnosi bioptica di tumori più piccoli e precedentemente
non rilevati (1), creando così un nuovo dilemma diagnostico: solo una frazione di uomini che
presentano aumentati livelli di PSA sierico hanno un cancro alla prostata rilevabile. Gli
uomini con almeno una biopsia negativa spesso presentano livelli persistentemente
aumentati di PSA sierico, dovuti principalmente a prostate ingrossate e ad iperplasia
prostatica benigna (IPB). Eppure, una proporzione significativa di uomini con livelli
leggermente aumentati di PSA sierico (2,5-4,0 µg/l) presentano, o svilupperanno, un cancro
alla prostata clinicamente significativo (1). Sebbene la biopsia resti il “gold standard” per il
rilevamento del cancro alla prostata, prove più accurate, con una migliore specificità, sono
necessarie per aiutare a guidare la decisione di eseguire una biopsia della prostata.
Il PCA3 (noto anche come “PCA3DD3” o “DD3PCA3”) è un RNA non codificante specifico della
prostata che viene iperespresso in elevate quantità nelle cellule cancerose della prostata,
con un livello mediano di 66 volte superiore alla norma rispetto al tessuto benigno adiacente
(2). In contrasto, l’espressione del gene PSA è simile nelle cellule cancerose e in quelle
benigne; i livelli di RNA del PSA possono quindi essere usati per standardizzare la quantità
di acido ribonucleico (RNA) specifico della prostata nei campioni per le prove molecolari. È
stata dimostrata l’attuabilità di analisi molecolari quantitative basate su PCA3 partendo da
sedimenti di urina (2) e da urina intera (3).
Il Progensa PCA3 Assay utilizza urina intera raccolta a seguito di esame digito-rettale (DRE)
consistente in tre pressioni per ciascun lobo. Il DRE libera le cellule della prostata -
attraverso il sistema di dotti di quest’ultima - nel tratto urinario, dove possono essere raccolte
nell’urina di primo getto. L’urina viene trattata mediante l’aggiunta del Mezzo di trasporto
dell’urina (UTM), che provoca la lisi delle cellule e stabilizza l’RNA. Gli RNA di PCA3 e PSA
vengono quantificati, e il PCA3 Score viene determinato in base al rapporto dell’RNA di
PCA3 e PSA. Oltre a standardizzare il segnale del PCA3, la misurazione dell’RNA del PSA
serve anche a confermare che il prodotto di RNA specifico della prostata è sufficiente a
generare un risultato valido. Un PCA3 Score superiore è correlato ad una più alta probabilità
di una biopsia della prostata positiva.
Principi della procedura
Il Progensa PCA3 Assay è composto da due prove quantitative di amplificazione degli acidi
nucleici. Il Progensa PCA3 Assay combina le tecnologie di cattura del target,
dell’amplificazione mediata dalla trascrizione (TMA) e del dosaggio con protezione
dell’ibridizzazione (HPA) per - rispettivamente - sveltire il trattamento dei campioni di urina,
amplificare l’RNA target e rilevare l’amplicone.
Progensa PCA3 Informazioni generali
Progensa PCA3 Assay 3
501377IT Rev. 003
Quando il Progensa PCA3 Assay viene eseguito in laboratorio, le molecole di RNA target
vengono isolate dai campioni di urina mediante cattura del target. Gli oligonucleotidi
(“oligonucleotidi di cattura”) che sono complementari alle regioni specifiche della sequenza
dei target vengono ibridizzati ai target presenti nel campione di urina. Per ciascun target
viene usato un oligonucleotide di cattura separato. Il target ibridizzato viene quindi catturato
su microparticelle magnetiche che vengono separate dal campione di urina in un campo
magnetico. Processi di lavaggio vengono utilizzati per rimuovere i componenti estranei dalla
provetta di reazione. I procedimenti di separazione magnetica e lavaggio vengono eseguiti
con un sistema di target capture.
L’amplificazione del target si verifica mediante TMA, che è un metodo di amplificazione degli
acidi nucleici basato su trascrizione che utilizza due enzimi, la trascrittasi inversa del virus
della leucemia murina di Moloney (MMLV) e la polimerasi dell’RNA T7. Per ciascun target
viene usata una serie univoca di primer. La trascrittasi inversa viene usata per generare una
copia di acido desossiribonucleico (DNA) (contenente una sequenza promotrice per la
polimerasi dell’RNA T7) della sequenza target. La polimerasi dell’RNA T7 produce copie
multiple di amplicone di RNA dal modello della copia di DNA.
Il rilevamento viene ottenuto mediante HPA usando sonde di acido nucleico con filamento
unico e marcatura chemiluminescente che sono complementari all’amplicone. Per ciascun
amplicone di target vengono usate sonde separate. Le sonde di acido nucleico marcate si
ibridizzano specificamente con l’amplicone. Il reagente di selezione distingue le sonde
ibridizzate da quelle non ibridizzate inattivando il marcatore sulle sonde non ibridizzate.
Durante il rilevamento, il segnale chemioluminescente emesso dalla sonda ibridizzata viene
misurato in un luminometro ed espresso in unità di luce relativa (RLU).
Gli RNA di PCA3 e PSA vengono quantificati in provette di reazione separate e viene
determinato il PCA3 Score. I calibratori contenenti quantità note di trascritti di RNA di PCA3
o PSA vengono inclusi in ogni seduta di dosaggio e usati per generare una curva standard.
I controlli di PCA3 e PSA vengono anch’essi inclusi per verificare l’accuratezza dei risultati
interpolati in base alla curva standard.
Progensa PCA3 Assay 4
501377IT Rev. 003
Reagenti e materiali forniti Progensa PCA3
Reagenti e materiali forniti
Nota: per informazioni sulle indicazioni di pericolo e i consigli di prudenza che possono
essere associati ai reagenti, consultare la libreria delle schede di sicurezza (Safety Data
Sheet Library) all’indirizzo www.hologic.com/sds.
Reagenti e materiali forniti nel Progensa PCA3/PSA Assay Kit per il Progensa PCA3 Assay
sono indicati sotto. Accanto al nome di ciascun reagente è indicato anche il rispettivo
simbolo identificativo.
Progensa PCA3 Assay Kit, 2 x 100 reazioni, N. di catalogo 302355 (8 scatole)
Progensa PCA3 100-Reaction Kit
Progensa PCA3 Scatola refrigerata – Conservare tra 2 C e 8 C dal momento del
ricevimento fino alla data di scadenza indicata
Progensa PCA3 Scatola a temperatura ambiente – Conservare tra 15 C e 30 C dal
momento del ricevimento fino alla data di scadenza indicata
Simbolo Componente Quantità
A PCA3 Reagente di amplificazione
Acidi nucleici non infettivi liofilizzati in soluzione tamponata HEPES
contenente < 10% di agente strutturante.
1 fiala
E Reagente enzimatico PCA3/PSA
Trascrittasi inversa e polimerasi dell’RNA liofilizzate in soluzione
tamponata HEPES contenente < 10% di reagente strutturante.
1 fiala
P Reagente sonda PCA3
Sonde di DNA non infettive chemiluminescenti liofilizzate in soluzione
tamponata con succinato contenente < 5% di agente strutturante e
< 5% di lauril solfato di litio.
1 fiala
Simbolo Componente Quantità
AR Soluzione di ricostituzione per amplificazione PCA3
Soluzione acquosa contenente conservanti (< 1% di parabenzoati).
1 x 9,3 ml
ER Soluzione di ricostituzione dell’enzima PCA3/PSA
Soluzione tamponata con HEPES contenente un surfattante
(Triton X-100 al 10%) e glicerolo al 20%.
1 x 3,3 ml
PR Soluzione di ricostituzione della sonda PCA3/PSA
Soluzione tamponata con succinato contenente < 5% di lauril solfato
di litio.
1 x 12,4 ml
S PCA3/PSA Reagente di selezione
Soluzione tamponata con borato contenente surfattante
(Triton X-100 all’1%).
1 x 31 ml
TCR Reagente di cattura del target PCA3
Acido nucleico non infettivo in soluzione tamponata HEPES
contenente una fase solida.
1 x 22 ml
Fogli sigillanti 1 confezione
Collari per ricostituzione 1 confezione
Progensa PCA3 Reagenti e materiali forniti
Progensa PCA3 Assay 5
501377IT Rev. 003
Progensa PCA3 Kit di calibratori e controlli – Conservare tra 2 C e 8 C dal momento del
ricevimento fino alla data di scadenza indicata
Progensa PSA 100-Reaction Kit
Progensa PSA Scatola refrigerata – Conservare tra 2 °C e 8 °C dal momento del ricevimento
fino alla data di scadenza indicata
Simbolo Componente Quantità
CAL Calibratore 1 PCA3
Soluzione tamponata con fosfato contenente < 5% di lauril solfato
di litio.
1 x 2,0 ml
CAL Calibratori PCA3 2-5
Acido nucleico di PCA3 non infettivo in soluzione tamponata con
fosfato contenente < 5% di lauril solfato di litio.
4 x 1,7 ml
PC Controlli positivi PCA3
Acido nucleico di PCA3 non infettivo in soluzione tamponata con
fosfato contenente < 5% di lauril solfato di litio.
2 x 1,7 ml
Scheda informativa sulla concentrazione di PCA3 1 foglio
Simbolo Componente Quantità
A Reagente di amplificazione del PSA
Acidi nucleici non infettivi liofilizzati in soluzione tamponata HEPES
contenente < 10% di agente strutturante.
1 fiala
E Reagente enzimatico PCA3/PSA
Trascrittasi inversa e polimerasi dell’RNA liofilizzate in soluzione
tamponata HEPES contenente < 10% di reagente strutturante.
1 fiala
P Reagente sonda PSA
Sonde di DNA non infettive chemiluminescenti liofilizzate in soluzione
tamponata con succinato contenente < 5% di agente strutturante e
< 5% di lauril solfato di litio.
1 fiala
Progensa PCA3 Assay 6
501377IT Rev. 003
Reagenti e materiali forniti Progensa PCA3
Progensa PSA Scatola a temperatura ambiente – Conservare tra 15 °C e 30 °C dal
momento del ricevimento fino alla data di scadenza indicata
Progensa PSA Kit di calibratori e controlli – Conservare tra 2 °C e 8 °C dal momento del
ricevimento fino alla data di scadenza indicata
Simbolo Componente Quantità
AR Soluzione di ricostituzione per amplificazione PSA
Soluzione acquosa contenente conservanti (< 1% di parabenzoati).
1 x 9,3 ml
ER Soluzione di ricostituzione dell’enzima PCA3/PSA
Soluzione tamponata con HEPES contenente un surfattante
(Triton X-100 al 10%) e glicerolo al 20%.
1 x 3,3 ml
PR Soluzione di ricostituzione della sonda PCA3/PSA
Soluzione tamponata con succinato contenente < 5% di lauril solfato di
litio.
1 x 12,4 ml
S PCA3/PSA Reagente di selezione
Soluzione tamponata con borato contenente surfattante
(Triton X-100 all’1%).
1 x 31 ml
TCR Reagente di cattura del target PSA
Acido nucleico non infettivo in soluzione tamponata HEPES
contenente una fase solida.
1 x 22 ml
Fogli sigillanti 1 confezione
Collari per ricostituzione 1 confezione
Simbolo Componente Quantità
CAL Calibratore 1 PSA
Soluzione tamponata con fosfato contenente < 5% di lauril solfato di
litio.
1 x 2,0 ml
CAL Calibratori 2-5 PSA
Acido nucleico di PSA non infettivo in soluzione tamponata con fosfato
contenente < 5% di lauril solfato di litio.
4 x 1,7 ml
PC Controlli positivi PSA
Acido nucleico di PSA non infettivo in soluzione tamponata con fosfato
contenente < 5% di lauril solfato di litio.
2 x 1,7 ml
Scheda informativa sulla concentrazione di PSA 1 foglio
Progensa PCA3 Reagenti e materiali forniti
Progensa PCA3 Assay 7
501377IT Rev. 003
Liquidi per Aptima Assay – Conservare tra 15 °C e 30 °C (2 scatole) dal momento del
ricevimento fino alla data di scadenza indicata
Nota - Tutti i materiali inclusi nel kit Progensa PCA3 Assay possono anche essere
acquistati separatamente (vedere la sezione Materiali per dettagli in merito).
Simbolo Componente Quantità
W Soluzione di lavaggio
Soluzione tamponata HEPES contenente < 2% di dodecilsolfato di
sodio.
1 x 402 ml
DF Tampone per fluido di disattivazione
Soluzione tamponata con bicarbonato.
1 x 402 ml
O Reagente oleoso
Olio di silicone.
1 x 24,6 ml
Progensa PCA3 Assay 8
501377IT Rev. 003
Materiali Progensa PCA3
Materiali
Nota: per informazioni sulle indicazioni di pericolo e i consigli di prudenza che possono
essere associati ai reagenti, consultare la libreria delle schede di sicurezza (Safety Data
Sheet Library) all’indirizzo www.hologic.com/sds.
Nota - Per i materiali disponibili presso Hologic sono indicati i rispettivi numeri di catalogo.
Materiali richiesti ma disponibili separatamente
Materiali opzionali
N. di cat.
Progensa PCA3 Urine Specimen Transport Kit
302352
Leader HC+ Luminometer 104747
Sistema di cattura del target (TCS) Hologic 104555
Kit Auto Detect Aptima 301048
2 pipettatori eppendorf Repeater Plus 105725
Puntali per pipettatori a ripetizione (2,5 ml, 5,0 ml, 25,0 ml) —
Uno dei seguenti articoli:
2 miscelatori vortex per unità multiprovetta 102160F
3 bagni di acqua circolante 104586F
(62 °C ± 1 °C, 42 °C ± 1 °C, 62 °C ± 1 °C)
3 distanziatori per bagni di acqua 104627
OPPURE
2 SB100 Dry Heat Bath/Vortexer 105524F
Ulteriori strumenti SB100 potrebbero essere richiesti,
a seconda della produttività desiderata
—
Micropipettatore, 1000 µl RAININ PR1000 901715
Puntali, 1000 µl P1000 105049
Pipettatore, eppendorf da 20 a 200 µl 105726
Puntali, pipetta da 20-200 µl —
Candeggina, dal 5% al 7% (da 0,7 M a 1,0 M) soluzione di ipoclorito di
sodio
—
Contenitore di plastica con coperchio grande —
Contenitori standard per la raccolta di urina, senza conservanti —
Unità a dieci provette (TTU) TU0022
Vassoi con dieci puntali (TTC) 104578
Standard di calibrazione SysCheck 301078
N. di cat.
Progensa PCA3 100-Reaction Kit 302354
Progensa PSA 100-Reaction Kit 302357
Progensa PCA3 Materiali
Progensa PCA3 Assay 9
501377IT Rev. 003
Progensa PCA3 Calibrators and Controls Kit 302353
Progensa PSA Calibrators and Controls Kit 302356
Progensa PCA3/PSA Proficiency Panels 302350
Progensa PCA3 Specimen Diluent Kit 302351
Kit di liquidi per dosaggio Aptima 302002C
Puntali monouso per pipetta con filtro (1 ml) 10612513 (Tecan)
TECAN Freedom EVO 100/4 900932
Gruppo piastra del piano PCA3, DTS 800 902021
Serbatoio del reagente (modulo diviso in quattro, da 40 ml) 104765
Serbatoio del reagente diviso (modulo diviso in quattro da 19 ml x 2) 901172
—
Provette di trasporto 302521
Tappi di ricambio perforabili 302520
Tappi di ricambio non perforabili 103036A
N. di cat.
Progensa PCA3 Assay 10
501377IT Rev. 003
Avvertenze e precauzioni Progensa PCA3
Avvertenze e precauzioni
A. Per uso diagnostico in vitro.
B. Solo per esportazione dagli USA.
Pertinenti al laboratorio
C. Usare solo contenitori da laboratorio monouso forniti o indicati in modo specifico come
monouso.
D. Adottare le consuete precauzioni di laboratorio. Non mangiare, bere o fumare nelle aree
di lavoro. Quando si maneggiano campioni di urina e reagenti del kit, indossare guanti
monouso senza talco, occhiali protettivi e camici da laboratorio. Lavarsi accuratamente le
mani dopo aver maneggiato campioni di urina e reagenti del kit.
E. Avvertenza – irritanti, corrosivi. Evitare il contatto dell’Auto Detect 1 e dell’Auto Detect
2 con la pelle, gli occhi e le mucose. Se questi liquidi vengono a contatto con la pelle o
con gli occhi, risciacquare con acqua le zone colpite. Se questi liquidi si rovesciano,
diluire il liquido rovesciato con acqua prima di asciugarlo con un panno.
F. Le superfici di lavoro, i pipettatori e le altre apparecchiature devono essere decontaminati
regolarmente con una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,5% - 3,5% (da 0,35 M a 0,5 M)
(vedere Note procedurali).
G. Per ridurre al minimo la contaminazione da ampliconi nel dosaggio, si raccomanda
caldamente di disporre di un’area separata per la post-amplificazione. Quest’area
dedicata dovrebbe essere lontana dall’area di pre-amplificazione, dove hanno luogo la
preparazione del reagente, la cattura del target e l’amplificazione.
H. Per contribuire ad evitare la contaminazione da ampliconi del laboratorio, disporre le aree
secondo un flusso di lavoro unidirezionale, dalla preparazione dei reagenti fino alla post-
amplificazione. Campioni, apparecchiature e reagenti non devono essere riportati
nell’area in cui è stata eseguita una fase procedurale precedente. Il personale non deve
ritornare nelle aree di lavoro precedenti senza adottare adeguate misure di salvaguardia
contro la contaminazione.
Pertinenti ai campioni
I. Dopo l’aggiunta dell’urina, il livello del liquido nella provetta di trasporto del campione di
urina deve rientrare inizialmente fra le due righe nere indicatrici marcate sull’etichetta
della provetta. In caso contrario, il campione va rifiutato.
J. Mantenere le corrette condizioni di conservazione durante la spedizione del campione,
per assicurarne l’integrità. La stabilità del campione in condizioni di spedizione diverse da
quelle raccomandate non è stata determinata.
K. Le date di scadenza indicate sui kit di raccolta si riferiscono al centro di raccolta e non al
laboratorio di analisi. I campioni raccolti in qualsiasi momento prima della data di
scadenza indicata nel kit di raccolta, e che siano trasportati e conservati seguendo le
istruzioni del foglietto illustrativo della confezione, sono validi per l’analisi anche se la
data di scadenza della provetta di raccolta è passata.
Progensa PCA3 Avvertenze e precauzioni
Progensa PCA3 Assay 11
501377IT Rev. 003
L. Conservare tutti i campioni alle temperature specificate. L’uso di campioni conservati in
modo erroneo può influire sulle prestazioni del dosaggio. Vedere Raccolta, trasporto e
conservazione dei campioni per istruzioni specifiche.
M. I campioni di urina potrebbero essere infettivi. Nell’eseguire questo dosaggio, adottare le
precauzioni universali. Metodi adeguati di manipolazione e smaltimento vanno stabiliti dal
direttore del laboratorio. Questa procedura va svolta solo da personale adeguatamente
qualificato e competente nell’uso del Progensa PCA3 Assay, e adeguatamente
addestrato nella manipolazione di materiali infettivi.
N. Evitare la contaminazione crociata durante i procedimenti di manipolazione dei campioni.
I campioni di urina possono contenere livelli elevati di RNA target. Assicurarsi che i
contenitori dei campioni non vengano in contatto tra di loro ed eliminare i materiali usati
senza farli passare sopra i contenitori aperti. Se i guanti entrano in contatto con un
campione, cambiarli per evitare la contaminazione incrociata.
Pertinenti al dosaggio
O. Non usare il kit dopo la data di scadenza.
P. Per il kit Progensa PCA3 Assay, non scambiare, mescolare o combinare reagenti
del dosaggio PCA3 provenienti da kit con numeri di lotto diversi; ciò significa che,
per ciascun analita, i reagenti per dosaggio nella scatola refrigerata e in quella a
temperatura ambiente devono provenire dallo stesso lotto. I reagenti del dosaggio
possono essere usati con kit di calibratori e controlli provenienti da lotti diversi. I kit di
liquidi per dosaggio Aptima sono interscambiabili. I kit di reagenti PCA3 e PSA non
devono obbligatoriamente essere abbinati l’uno con l’altro.
Q. Conservare tutti i reagenti del dosaggio alle temperature specificate. L’uso di reagenti
conservati in modo erroneo può influire sulle prestazioni del dosaggio. Vedere Requisiti di
conservazione e manipolazione e Note procedurali per istruzioni specifiche.
R. Per la disattivazione del dosaggio (vedere Procedura di analisi), la concentrazione
minima dell’ipoclorito di sodio deve essere del 2,5% (0,35 M) dopo la diluizione 1:1 con
il tampone di disattivazione. Pertanto, la soluzione di ipoclorito di sodio di partenza deve
avere una concentrazione compresa tra il 5% e il 7% (da 0,7 M a 1,0 M) per raggiungere
la concentrazione finale richiesta per la disattivazione.
S. Usare puntali con tappi idrofobi. A questo dosaggio vanno dedicati almeno due pipettatori
a ripetizione: uno da usare per le fasi di pre-amplificazione e uno per le fasi di post-
amplificazione. A meno che non si usi lo strumento TECAN Freedom EVO 100/4, occorre
dedicare un micropipettatore al trasferimento dei campioni. Tutti i pipettatori vanno puliti
regolarmente come descritto nelle Note procedurali.
T. Quando si usano pipettatori a ripetizione per l’aggiunta dei reagenti, non toccare la
provetta di reazione con il puntale del pipettatore, onde evitare il carryover da una
provetta all’altra.
U. Per ottenere risultati accurati del dosaggio occorre una miscelazione adeguata. Per
dettagli completi, vedere Note procedurali.
V. Ai procedimenti di pre-amplificazione, amplificazione e post-amplificazione vanno dedicati
bagni di acqua separati.
Progensa PCA3 Assay 12
501377IT Rev. 003
Avvertenze e precauzioni Progensa PCA3
W. Alcuni reagenti di questo kit presentano etichette con simboli di rischio e sicurezza, in
osservanza della Direttiva europea 1999/45/CE, e vanno manipolati di conseguenza.
Schede sulla sicurezza dei materiali possono essere visualizzate presso il sito
www.hologic.com e sono disponibili dietro richiesta.
Progensa PCA3 Requisiti di conservazione e manipolazione
Progensa PCA3 Assay 13
501377IT Rev. 003
Requisiti di conservazione e manipolazione
A. Per informazioni sulla conservazione dei reagenti, consultare la Tabella 1.
B. Non conservare il reagente Target Capture a temperature inferiori a 15 °C.
C. Il reagente sonda e il reagente sonda ricostituito sono fotosensibili. Proteggere questi
reagenti da una prolungata esposizione alla luce durante il magazzinaggio e la
preparazione all’uso.
D. Non congelare i reagenti.
E. Non usare i reagenti né i liquidi dopo la data di scadenza.
F. I calibratori ed i controlli Progensa PCA3 e PSA sono flaconi da utilizzare per un’unica
seduta e vanno smaltiti dopo l’uso.
G. Cambiamenti nell’aspetto fisico del reagente fornito possono indicare instabilità o
deterioramento di questi materiali. Se si notano cambiamenti nell’aspetto fisico dei
reagenti una volta che siano stati rimessi in sospensione (per es. evidenti cambiamenti
nel colore o nella torbidità del reagente indicativi di contaminazione microbica), contattare
l’Assistenza tecnica Hologic prima dell’uso.
H. Eliminare il reagente ricostituito dopo 30 giorni o entro la data di scadenza, a seconda di
quale data cada per prima.
Tabella 1: Conservazione dei reagenti
Reagente/Liquido Conservazione dei prodotti non
aperti
Aperti/Ricostituiti
Stabilità (fino alla data di
scadenza)
Reagenti di amplificazione 2 °C - 8 °C fino alla data di scadenza 30 giorni a 2 °C - 8 °C*
Reagenti sonda 2 °C - 8 °C fino alla data di scadenza 30 giorni a 2 °C - 8 °C*
Reagente enzimatico 2 °C - 8 °C fino alla data di scadenza 30 giorni a 2 °C - 8 °C*
Reagenti Target Capture 15 °C - 30 °C fino alla data di scadenza 30 giorni a 15 °C - 30 °C
Soluzione di ricostituzione
amplificazione 2 °C - 30 °C fino alla data di scadenza N/P (monouso)
Soluzione di ricostituzione
sonda 2 °C - 30 °C fino alla data di scadenza N/P (monouso)
Soluzione di ricostituzione
enzimi 2 °C - 30 °C fino alla data di scadenza N/P (monouso)
Reagente di selezione 2 °C - 30 °C fino alla data di scadenza 30 giorni a 15 °C - 30 °C
Calibratori 2 °C - 8 °C fino alla data di scadenza N/P (seduta singola)
Controlli 2 °C - 8 °C fino alla data di scadenza N/P (seduta singola)
Reagente oleoso 15 °C - 30 °C fino alla data di scadenza 30 giorni a 15 °C - 30 °C
Soluzione di lavaggio 15 °C - 30 °C fino alla data di scadenza 30 giorni a 15 °C - 30 °C
Tampone per fluido di
disattivazione 15 °C - 30 °C fino alla data di scadenza 28 giorni a 15 °C - 30 °C
*Si può usare di nuovo per altre sedute di dosaggio fino a quattro volte, purché la quantità totale di tempo in cui resta a
temperatura ambiente non sia superiore alle 24 ore.
Progensa PCA3 Assay 14
501377IT Rev. 003
Requisiti di conservazione e manipolazione Progensa PCA3
I. Avanzi di reagenti aperti o ricostituiti possono essere usati in dosaggi successivi se
sono stati conservati adeguatamente dopo l’uso iniziale. Il reagente avanzato può
essere unito a reagenti appena preparati o ad altri reagenti avanzati dello stesso lotto.
Non scambiare, mescolare o combinare reagenti provenienti da kit con numeri
di lotto diversi (vedere Avvertenze e precauzioni). Nessun componente del reagente
raggruppato può superare i limiti di conservazione dei reagenti aperti o ricostituiti.
Assicurarsi che il reagente raggruppato sia stato miscelato accuratamente e che sia
stato preparato un volume sufficiente a fornire abbastanza reagente per un’intera
seduta di dosaggio.
Progensa PCA3 Raccolta, trasporto e conservazione dei campioni
Progensa PCA3 Assay 15
501377IT Rev. 003
Raccolta, trasporto e conservazione dei campioni
Il Progensa PCA3 Assay è concepito per la quantificazione dell’RNA di PCA3 e PSA
nell’urina di primo getto raccolta dopo un DRE consistente in tre pressioni per ciascun
lobo. L’urina viene trattata usando il Progensa PCA3 Urine Specimen Transport Kit. La
stabilità dell’RNA di PCA3 e PSA nell’urina e nell’urina trattata è stata stabilita
monitorando i livelli delle copie di RNA nei campioni di urina raccolti seguendo le istruzioni
indicate sotto.
A. Istruzioni per la raccolta e il trattamento dei campioni di urina:
1. Si consiglia di chiedere al paziente di bere una grande quantità d’acqua (circa
500 ml) per essere certi di ottenere una quantità di urina sufficiente per la raccolta.
2. Subito prima della raccolta di urina, eseguire un esame digito-rettale (DRE) come
descritto sotto:
Applicare pressione sulla prostata, abbastanza da comprimere la superficie di circa
1 cm, dalla base all’apice e dalla linea laterale a quella mediana per ciascun lobo,
come illustrato nella Figura 1. Eseguire esattamente tre pressioni per ciascun lobo.
Questa operazione non va intesa come un massaggio prostatico.
Figura 1. Giusta direzione della pressione applicata alla prostata
3. Dopo il DRE, chiedere al paziente di raccogliere l’urina di primo getto
(circa 20-30 ml del getto di urina iniziale) in una coppetta per raccolta
adeguatamente etichettata. Deve essere il campione di urina del primo getto
successivo al DRE. Usare una coppetta per raccolta priva di qualsiasi conservante.
Se un paziente non riesce a interrompere il flusso di urina e fornisce una quantità
di urina superiore ai primi 20-30 ml richiesti, conservare l’intero volume fornito. Se
il paziente non è in grado di fornire il volume di urina richiesto, si tenga presente
che per eseguire il Progensa PCA3 Assay sono necessari almeno 2,5 ml di urina.
In caso contrario, il campione va rifiutato.
Nota - Volumi di urina molto grandi possono abbassare le concentrazioni degli
analiti PCA3 e PSA e più raramente possono rendere il campione non valido. Per
questo motivo, il paziente dovrebbe evitare di riempire la coppetta per la raccolta
dell’urina.
4. I campioni di urina non trattati, se non vengono trattati immediatamente,
devono essere mantenuti ad una temperatura compresa fra 2 °C e 8 °C,
oppure conservati sotto ghiaccio. Il campione di urina raffreddato e non
trattato va trasferito nella provetta di trasporto del campione di urina entro
4 ore dalla raccolta. In caso contrario, il campione va rifiutato e occorre
raccogliere un nuovo campione. Non congelare i campioni di urina non
trattati.
Left Lobe
Right Lobe
Apex
Base
Lobo sinistro Lobo destro
Base
Apice
Progensa PCA3 Assay 16
501377IT Rev. 003
Raccolta, trasporto e conservazione dei campioni Progensa PCA3
5. Per trattare i campioni di urina, chiuderli bene e capovolgerli 5 volte per rimettere
le cellule in sospensione. Togliere il tappo della provetta di trasporto del campione
di urina e poi, con la pipetta di trasferimento monouso fornita, trasferire nella
provetta 2,5 ml di urina raccolta. Il giusto volume di urina sarà stato aggiunto
quando il livello del liquido si troverà fra le righe di riempimento nere stampate
sull’etichetta della provetta di trasporto del campione di urina.
6. Richiudere bene il tappo sulla provetta di trasporto del campione di urina e
capovolgere 5 volte il campione per miscelarlo. Questo sarà ora il campione di
urina trattato.
B. Trasporto e conservazione dei campioni prima dell’analisi:
1. I campioni di urina trattati devono essere trasportati al laboratorio nella provetta di
trasporto del campione di urina. La spedizione dei campioni può avvenire in
condizioni ambientali non controllate (senza controllo della temperatura) o in fase
di congelamento. Devono essere prese disposizioni per il trasporto per assicurare
che i campioni vengano ricevuti presso il laboratorio di analisi entro 5 giorni dalla
raccolta.
Una volta ricevuto il campione, il laboratorio deve verificarne la data di raccolta
riportata sulla provetta. Se i campioni sono stati spediti in condizioni ambientali non
controllate e sono stati ricevuti dopo più di 5 giorni dalla raccolta, dovranno
essere rifiutati e occorrerà richiedere nuovi campioni. Il laboratorio può conservare
i campioni ad una temperatura compresa fra 2 °C e 8 °C per un massimo di
14 giorni. Dopodiché il campione dovrà essere smaltito. Se sono necessari periodi
più lunghi, consultare la Tabella 2 in cui sono riportati i tempi di conservazione
consentiti a diverse temperature.
Tabella 2: Durata di conservazione dei campioni di urina trattati
2. I campioni di urina trattati possono essere sottoposti al massimo a 5 cicli di
congelamento-scongelamento.
C. Conservazione dei campioni dopo l’analisi:
1. I campioni analizzati devono essere conservati su una rastrelliera, in posizione
verticale.
2. Le provette di trasporto dei campioni di urina, se non vengono richiuse con un
tappo intatto, vanno coperte con una nuova barriera pulita di plastica o alluminio.
3. Se i campioni analizzati devono essere congelati o spediti, rimuovere i tappi
perforabili e sostituirli con nuovi tappi non perforabili sulle provette di trasporto del
campione. Qualora sia necessario inviare i campioni presso altri laboratori di
analisi, è necessario mantenerli alle temperature consigliate. Evitare schizzi e
contaminazione incrociata.
Nota - La spedizione dei campioni deve essere effettuata in conformità ai regolamenti
applicabili relativi al trasporto nazionale e internazionale.
Temperatura di conservazione Tempi
Conservazione e spedizione dei campioni trattati: fino a 5 giorni*
Dopo la ricezione presso il laboratorio di analisi:
da 2 °C a 8 °C fino a 14 giorni
da -35 °C a -15 °C fino a 11 mesi**
a -65 °C o temperatura inferiore fino a 36 mesi**
*Tempo consentito per la spedizione in condizioni ambientali non controllate o in fase
di congelamento.
**Tempo consentito dopo la conservazione in fase di congelamento.
Progensa PCA3 Procedura di analisi
Progensa PCA3 Assay 17
501377IT Rev. 003
Procedura di analisi
A. Preparazione dell’area di lavoro
1. Regolare un bagno di acqua su 62 °C ± 1 °C per la pre-amplificazione, un secondo
bagno di acqua su 42 °C ± 1 °C per l’amplificazione ed un terzo su 62 °C ± 1 °C per
la post-amplificazione. Assicurarsi che i bagni di acqua contengano una quantità
d’acqua sufficiente (vedere Note procedurali). Se si usa l’SB100 Dry Heat Bath/
Vortexer, consultare la Scheda applicativa dell’SB100 Dry Heat Bath/Vortexer per il
Progensa PCA3 Assay (Scheda applicativa dell’SB100).
2. Prima di iniziare il dosaggio, pulire le superfici di lavoro e i pipettatori con una
soluzione di ipoclorito di sodio al 2,5% - 3,5% (da 0,35 M a 0,5 M). Lasciare la
soluzione di ipoclorito di sodio a contatto con le superfici e i pipettatori per almeno 1
minuto, quindi risciacquare con acqua. Non lasciare asciugare la soluzione di
ipoclorito di sodio. Coprire la superficie del banco sul quale verrà eseguita l’analisi
con teli da banco di laboratorio puliti, assorbenti e plastificati.
3. Disporre nel sistema di cattura del target (TCS) un numero sufficiente di vassoi con
dieci puntali. Assicurarsi che il flacone di lavaggio del TCS sia pieno di soluzione di
lavaggio e che l’aspiratore sia collegato alla pompa di aspirazione. (Consultare il
Manuale d’uso del sistema di cattura del target.)
B. Ricostituzione e preparazione dei reagenti
Prima di iniziare il trasferimento dei campioni, occorre eseguire la ricostituzione dei
reagenti.
1. Per ricostituire i reagenti di amplificazione, enzimatico e sonda, unire il contenuto dei
flaconi di reagente liofilizzato alla soluzione di ricostituzione. Se le soluzioni di
ricostituzione sono state refrigerate, prima dell’uso lasciare che raggiungano la
temperatura ambiente.
Figura 2. Processo di ricostituzione
a. Abbinare l’appropriata soluzione di ricostituzione al suo reagente liofilizzato.
Verificare che i flaconi abbiano etichette dello stesso colore per assicurarsi che
siano abbinati correttamente.
b. Aprire il flacone del reagente liofilizzato e inserire con fermezza l’estremità
indentata del collare di ricostituzione nell’apertura del flacone (Figura 2, Passaggio
1).
Progensa PCA3 Assay 18
501377IT Rev. 003
Procedura di analisi Progensa PCA3
c. Aprire il flacone della soluzione di ricostituzione corrispondente e disporne il
tappo su una superficie di lavoro pulita e coperta. Tenendo il flacone della
soluzione sul banco, inserire con fermezza l’altra estremità del collare di
ricostituzione nell’apertura del flacone (Figura 2, Passaggio 2).
d. Capovolgere lentamente la bottiglia con il flacone collegato. Lasciar drenare la
soluzione dal flacone alla fiala di vetro (Figura 2, Passaggio 3). Attendere che il
reagente liofilizzato vada in soluzione, quindi agitare ruotando delicatamente la
soluzione nel flacone di vetro per miscelarla. Nel roteare il flacone, evitare la
formazione di schiuma (Figura 2, Passaggio 4).
e. Capovolgere il gruppo e inclinarlo ad un angolo di 45° per ridurre al minimo la
formazione di schiuma (Figura 2, Passaggio 5). Lasciare che tutto il liquido
ritorni nella bottiglia di plastica.
f. Rimuovere il collare di ricostituzione e la fiala di vetro (Figura 2, Passaggio 6).
g. Richiudere il flacone di plastica (Figura 2, Passaggio 7). Annotare le iniziali
dell’operatore e la data di ricostituzione su tutte le fiale di reagente ricostituito.
Assicurarsi di annotare l’analita (PCA3 o PSA) sui flaconi del reagente sonda.
h. Gettare via sia il collare di ricostituzione che la fiala di vetro (Figura 2,
Passaggio 8).
2. I reagenti sonda, di amplificazione ed enzimatici precedentemente ricostituiti
devono essere portati a temperatura ambiente (da 15 °C a 30 °C) prima di iniziare
il dosaggio. Se si raggruppano reagenti avanzati, consultare Requisiti di
conservazione e manipolazione. Se il reagente di amplificazione ricostituito
contiene precipitato che non rientra in soluzione a temperatura ambiente,
riscaldarlo a 62 °C ± 1 °C per 1-2 minuti nell’area di pre-amplificazione. Se il
reagente sonda ricostituito contiene precipitato che non rientra in soluzione a
temperatura ambiente, riscaldarlo a 62 °C ± 1 °C per 1-2 minuti nell’area di post-
amplificazione. Dopo questi procedimenti di riscaldamento, i reagenti ricostituiti
possono essere usati anche se resta del precipitato residuo. Dopo la
risospensione, miscelare i flaconi capovolgendoli delicatamente.
C. Preparazione delle rastrelliere
Il pipettatore a ripetizione usato nella cattura del target, nel trasferimento dei campioni
e nell’amplificazione deve essere dedicato per l’uso solo in questi passaggi (vedere
Avvertenze e precauzioni).
1. Approntare una rastrelliera per l’analita PCA3 ed un’altra rastrelliera per
l’analita PSA.
Nota - Se il numero di campioni è abbastanza basso, entrambi gli analiti possono
essere analizzati in un’unica rastrelliera. Se si usa lo strumento TECAN Freedom
EVO 100/4, per ciascun analita va usata una rastrelliera separata. Non si possono
analizzare più di due rastrelliere complete (20 TTU) alla volta.
2. Nella/e rastrelliera/e per unità a dieci provette (TTU), disporre abbastanza TTU da
poter alloggiare i calibratori, i controlli ed i campioni per ciascun analita.
3. Etichettare le TTU con gli ID campione. La Tabella 3 descrive l’aggiunta di
calibratori, controlli e campioni. Avviare i calibratori PSA su una nuova TTU.
Nota - I calibratori vanno eseguiti in tre replicati ed i controlli in due replicati
ciascuno, e devono essere eseguiti sulla stessa rastrelliera dei campioni. I
campioni vanno eseguiti in replicato. Non lasciare tubi di reazione vuoti fra
calibratori, controlli e campioni. Se si usa lo strumento TECAN Freedom EVO
100/4, consultare la Scheda applicativa del TECAN Freedom EVO 100/4 per il
Progensa PCA3 Assay (Scheda applicativa del TECAN Freedom EVO) per ulteriori
istruzioni.
Progensa PCA3 Procedura di analisi
Progensa PCA3 Assay 19
501377IT Rev. 003
Tabella 3: Esempio di approntamento di rastrelliera
D. Verifica delle informazioni sulle concentrazioni
Verificare con l’amministratore di sistema del Progensa PCA3 Assay Software che
siano state immesse le informazioni sulle concentrazioni per i lotti dei kit di calibratori
e controlli Progensa PCA3 e PSA analizzati. Per ulteriori informazioni, consultare la
Guida di riferimento rapido per il Progensa PCA3 Assay (Guida di riferimento rapido) o
il Manuale d’uso dell’amministratore di sistema del Progensa PCA3 Assay Software.
Nota - Si richiede l’immissione delle informazioni sulle concentrazioni prima dell’uso
iniziale di ciascun nuovo lotto di kit di calibratori e controlli. Le sedute successive che
impiegano calibratori e controlli derivanti dallo stesso lotto di kit non richiedono
ulteriore azione.
E. Approntamento del Worklist Editor
Generare una lista di lavoro per la seduta del dosaggio usando il Hologic Worklist
Editor su un computer situato nell’area di pre-amplificazione. Per l’uso del Worklist
Editor, consultare la Guida di riferimento rapido o il Manuale d’uso del Hologic Worklist
Editor. Se si usa lo strumento TECAN Freedom EVO 100/4, consultare anche la
Scheda applicativa del TECAN Freedom EVO per ulteriori istruzioni.
F. Preparazione dei campioni
1. Prima dell’analisi, lasciare che calibratori e controlli raggiungano la temperatura
ambiente. Miscelare i flaconi capovolgendoli delicatamente.
2. Prima dell’analisi, lasciare che i campioni raggiungano la temperatura ambiente.
Non mettere i campioni nel vortex. I campioni vanno miscelati mediante
capovolgimento occasionale e delicato durante il periodo di riscaldamento. Vedere
le Note procedurali per informazioni sul precipitato che non torna in soluzione e
sulla manipolazione dei campioni congelati.
G. Pre-amplificazione
L’ambiente di pre-amplificazione deve trovarsi a temperature comprese fra 15 °C e
30 °C. Analizzare in parallelo entrambe le rastrelliere. Se si usa l’SB100 Dry Heat
Bath/Vortexer, consultare la Scheda applicativa dell’SB100. Se si usa lo strumento
TECAN Freedom EVO 100/4, consultare la Scheda applicativa del TECAN Freedom
EVO per ulteriori istruzioni.
Rastrelliera
Posizione
Campione
Descrizione
*Concentrazione
PCA3 target
(copie/ml)
*Concentrazione
PSA target
(copie/ml)
da 1 a 3 Calibratore 1 0 0
da 4 a 6 Calibratore 2 250 7500
da 7 a 9 Calibratore 3 2500 75.000
da 10 a 12 Calibratore 4 25.000 750.000
da 13 a 15 Calibratore 5 125.000 3.000.000
da 16 a 17 Controllo A 1250 37.500
da 18 a 19 Controllo B 62.500 1.500.000
da 20 a n Campione clinico sconosciuto sconosciuto
*Calibratori e controlli positivi di PCA3 e PSA hanno valori assegnati, quindi i valori effettivi di
copie/ml per i calibratori da 2 a 5 e per i controlli A e B saranno leggermente diversi dalle
concentrazioni target indicate nella tabella e varieranno da un lotto all’altro. Le informazioni sulla
concentrazione vengono fornite su una scheda contenuta nella confezione delle fiale di calibratore
e controllo e sono usati per la calibrazione e per la determinazione della validità della seduta.
Progensa PCA3 Assay 20
501377IT Rev. 003
Procedura di analisi Progensa PCA3
1. Miscelare accuratamente il reagente Target Capture (TCR) mediante inversione o
con movimento rotatorio. Usando il pipettatore a ripetizione, aggiungere 100 µl di
TCR specifico dell’analita alla provetta di reazione appropriata.
2. Forare il tappo del flacone del calibratore con il micropipettatore e aggiungere
400 µl del calibratore alla provetta di reazione appropriatamente etichettata.
Usando lo stesso puntale di pipetta, prelevare aggiunte di replicato dal flacone
attraverso il tappo forato. Usare nuovi puntali di pipetta per ciascun flacone di
calibratore. Ripetere per l’aggiunta di controlli e campioni. Coprire e salvare
eventuali campioni avanzati e conservarli ad una temperatura di 8 °C o inferiore
(vedere Raccolta, trasporto e conservazione dei campioni per ulteriori informazioni)
nel caso fosse necessario ripetere l’analisi.
3. Coprire le TTU con i fogli sigillanti e agitare delicatamente a mano la rastrelliera.
Non metterla sul vortex. Incubare la rastrelliera a 62 °C ± 1 °C in un bagno di
acqua per 30 ± 5 minuti.
4. Estrarre la rastrelliera dal bagno di acqua e asciugare il fondo delle provette su un
materiale assorbente.
5. Assicurarsi che i fogli sigillanti siano bene alloggiati. Se necessario, sostituirli con
altri fogli sigillanti nuovi e sigillare bene le TTU.
6. Agitare la rastrelliera per 60 secondi, mettendola sul miscelatore vortex per unità
multiprovetta (vedere Note procedurali). Iniziare l’agitazione su vortex entro
2 minuti dalla rimozione della rastrelliera dal bagno di acqua.
7. Senza rimuovere i fogli sigillanti, incubare la rastrelliera a temperatura ambiente
per 30 ± 5 minuti.
8. Mettere la rastrelliera sulla base magnetica del TCS per 5-10 minuti, con la
linguetta frontale rivolta in avanti. Caricare la rastrelliera per TTC con i TTC.
9. Eseguire il priming delle linee della pompa della stazione di dispensazione
pompando la soluzione di lavaggio attraverso il collettore di dispensazione.
Pompare attraverso il sistema liquido sufficiente per eliminare le bolle d’aria dalla
linea e per erogare da tutti e 10 i beccucci un flusso costante di liquido.
10. Accendere la pompa di aspirazione e scollegare il collettore di aspirazione in
corrispondenza del primo connettore fra l’aspiratore e il flacone di cattura.
Assicurarsi che il vacuometro sia conforme alle specifiche delle prove di rilevamento
delle perdite. Possono essere necessari 15 secondi per ottenere questa lettura.
Ricollegare il collettore e assicurarsi che il vacuometro soddisfi le specifiche di livello
del vuoto. Lasciare accesa la pompa di aspirazione fino a quando tutti i passaggi di
cattura del target sono completati e il collettore di aspirazione è asciutto.
Consultare la scheda delle specifiche di aspirazione del Sistema Target Capture,
situata sul retro del Manuale d’uso del Sistema Target Capture o contattare
l’Assistenza tecnica Hologic per ulteriori informazioni.
11. Collegare saldamente il collettore di aspirazione alla prima serie di puntali.
Abbassare i puntali nella prima TTU fino a quando non entrino a contatto con la
sommità del liquido. Mantenere il contatto dei puntali con la sommità del liquido
mentre si muovono verso il basso, finché non entrino brevemente a contatto con il
fondo delle provette. Picchiettare delicatamente i puntali contro il fondo delle provette
fino ad espellere tutto il liquido residuo. Non tenere i puntali a contatto prolungato
con il fondo delle provette né picchiettare i puntali rapidamente, poiché ciò potrebbe
causare un’eccessiva formazione di schiuma nel contenitore di cattura sotto vuoto.
12. Al termine dell’aspirazione, espellere i puntali nel rispettivo vassoio originale
portapuntali. Ripetere i passaggi di aspirazione per le TTU restanti, usando per
ogni provetta di reazione un puntale dedicato.
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