6 Separazione dei linfociti B e T:
6.1 Procedura con lana di nylon:
I linfociti B e T sono facilmente separabili per mezzo dell’utilizzo della tecnica della lana di nylon. I macrofagi ed i
linfociti B aderiscono alla lana di nylon, mentre i linfociti T non possiedono questa proprietà. Per ulteriori informazioni
sulla procedura di separazione dei linfociti B e T pregasi consultare la 4a Edizione del Manuale delle procedure di
laboratorio redatto da ASHI, Sezione 1.A.6 “Separazione tramite lana di nylon dei linfociti B e T”.
6.2 Procedura tramite microsfere:
6.2.1 Le microsfere magnetiche sono acquistabili presso diversi produttori.
6.2.2 Il Preparato di cellule HLA I ed il Preparato di cellule HLA II (Invitrogen™) sono stati testati per l’uso con le
piastredelle classi I e II. Pregasi consultare le Istruzioni per l’uso fornite da ciascun produttore.
6.2.3 I linfociti B e T purificati mediante microsfere sono generalmente pre-colorati con diacetato carbossi-fluoresceina
(Carboxyfluorescein Diacetate, CFDA) o bromuro di etidio.
7 Test di microlinfocitotossicità:
7.1 Preparare una sospensione linfocitaria con una vitalità minima dell’80% senza contaminazione eccessiva delle cellule
non linfocitarie.
7.2 Estrarre le piastredi tipizzazione HLA di Invitrogen™ dal congelatore, scongelare e lasciare che le piastreraggiungano la
temperatura ambiente per l’esecuzione immediata del test. Riporre le restanti piastrecongelate in un congelatore no-frost
impostato su una temperatura pari o inferiore a -55°C.
7.2.1 Le piastre di cui sia stata aperta la confezione devono essere utilizzate immediatamente o possono essere conservate per
un periodo massimo di un mese ad una temperatura pari o inferiore a -55°C.
7.3 Utilizzando una siringa da 50 µl, aggiungere 1 µl di soluzione linfocitaria (approssimativamente 3.000 linfociti) nella
parte superiore di ciascun pozzetto del test, facendo attenzione a non toccare gli antisieri. Esaminare ciascun pozzetto
onde accertare l’avvenuta miscelazione della sospensione linfocitaria e dell’antisiero.
7.4 Incubare le piastre a temperatura ambiente (22°C ± 3°C).
Classe I (esclusione del colorante) 30 min
Classe I (fluorescenza) 30 min
Classe II (fluorescenza) 45 min
7.5 Utilizzando una siringa da 250 µl, aggiungere 5 µl del complemento di coniglio incluso nella confezione della piastra nei
pozzetti del test, facendo attenzione a non toccare la miscela di antisieri/linfociti con le punte delle siringhe.
Nota: le piastre di tipizzazione sono state ottimizzate con la partita di complementofornito con l’attrezzatura.
L’impiego di un complemento diverso potrebbe generare reazioni deboli o risultati falsi positivi.
7.6 Incubare le piastre a temperatura ambiente (22°C ± 3°C).
Classe I (esclusione del colorante) 60 min
Classe I (fluorescenza) 50 min
Classe II (fluorescenza) 60 min
7.7 Utilizzando una siringa da 100 µl o equivalente, aggiungere 2 µl di eosina Y acquosa filtrata al 5% in ciascun pozzetto
del test ed incubare a temperatura ambiente (22°C ± 3°C) per 3-5 minuti. Fare attenzione che le punte delle siringhe non
entrino in contatto con la miscela di antisieri/linfociti. Omettere questa fase se si conduce il test con fluoresceina.
7.8 Utilizzando una siringa da 250 µl, aggiungere 5 µl di formalina neutralizzata filtrata in ciascun pozzetto del test, facendo
attenzione a non toccare la miscela di antisieri/linfociti. Omettere questa fase nei test condotti con fluoresceina.
7.8.1 Prove con fluorosceina: aggiungere 5 µl di ioduro di propidio in una soluzione di quenching in ciascun pozzetto del
test, facendo attenzione a non toccare la miscela di antisieri/linfociti.
7.9 Ricoprire la piastra con un vetrino di copertura e lasciare riposare le piastre a temperature ambiente per 15 minuti per
consentire ai linfociti di sedimentarsi.
7.9.1 Le piastre marcate con l’eosina Y possono essere lette dopo un’ora o il giorno successivo.
7.9.2 Le piastre marcate con la fluorosceina possono essere lette dopo 30 minuti o il giorno successivo.
Nota: la lettura di una piastra marcata con fluoresceina dopo 36 ore potrebbe comportare un incremento dei
risultati falsi positivi.
7.10 Esaminare il test mediante osservazione microscopica con ingrandimento 150 x impiegando la tecnica di illuminazione a
contrasto di fase.
8 Risultati:
8.1 Le cellule morte (ovvero le cellule contenenti l’antigene) assorbono il colorante, appaiono ingrandite e scurite ed
esibiscono un dettaglio nucleare distintivo. Le cellule vitali (ovvero cellule prive dell’antigene), escludono il colorante,
appaiono lievemente più luminose ed esibiscono una dimensione ridotta rispetto alle cellule morte.
8.2 Alternativamente, le cellule vitali marcate mediante fluorescenza presentano una colorazione verde mentre le cellule non
vitali appaiono rosse.