3M Allergen Protein ELISA Kit Istruzioni per l'uso

Tipo
Istruzioni per l'uso
(Italiano)
IT
1
Data di pubblicazione: 2017-11
Istruzioni sul prodotto
Kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola
Analisi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per l'analisi quantitativa delle proteine di nocciola.
Descrizione del prodotto e uso previsto
Il kit ELISA 3M™ per la rilevazione delle proteine di nocciola è indicato per la rilevazione delle proteine di nocciola
nell'acqua di risciacquo nale nei processi Clean in Place (CIP), nei campioni di tamponi ambientali, negli ingredienti
alimentari e nei prodotti alimentari trattati.
Il kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M utilizza un ELISA a sandwich. Le proteine di nocciola
presenti nel campione reagiscono con l'anticorpo anti-nocciola, il quale è stato assorbito dalla supercie dei pozzetti
di microtitolazione in polistirene. In seguito alla rimozione di proteine non legate tramite il lavaggio, vengono aggiunti
anticorpi anti-nocciola coniugati a perossidasi del rafano (HRP). Questi anticorpi enzimatici formano complessi con la
proteina di nocciola precedentemente legata. In seguito a una seconda fase di lavaggio, l'enzima legato all'immuno-
assorbente viene rilevato tramite l'aggiunta di un substrato cromogenico, la 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). Lo
sviluppo di colori derivante da questa reazione enzimatica varia a seconda della concentrazione di proteina di nocciola
nel campione testato; pertanto, l'assorbanza, a 450 nm, è una misura della concentrazione di proteina di nocciola nel
campione di test. La quantità di proteina di nocciola presente nel campione di test può essere estrapolata dalla curva
standard, costruita dagli standard della concentrazione nota e regolata al ne di considerare la diluizione del campione.
Il kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M deve essere utilizzato in laboratorio da professionisti che
conoscono le tecniche di laboratorio. 3M non ha documentato l'utilizzo del presente prodotto in settori diversi da quello
alimentare e delle bevande. Ad esempio, 3M non ha documentato il presente prodotto per l'analisi su campioni di tipo
farmaceutico, cosmetico, clinico o veterinario. Il kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M non è stato
valutato con tutti i prodotti alimentari, i processi alimentari e i protocolli di test possibili.
Il kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M contiene 96 pozzetti, descritti nella Tabella 1.
Tabella 1. Componenti del kit
Articolo Identicazione Preparazione
(consultare la sezione
Preparazione dei
reagenti per maggiori
dettagli)
Conservazione Stabilità
Pozzetti ELISA 3M™
per la rilevazione delle
proteine di nocciola
Una sacca di alluminio con
una piastra di 96 pozzetti
rimovibili rivestiti di
anticorpi.
Pronto all'uso. 2-8 °C nella
sacca di
alluminio
sigillata con
essiccante.
Sacca di alluminio
risigillabile
contenente
essiccante e
pozzetti inutilizzati.
Conservare a 2-8 °C
per mantenere una
stabilità adeguata no
alla data di scadenza
del kit.
Coniugato HRP di
nocciola 3M™ (10X)
Una ala contenente 1,5 ml
di anticorpo coniugato a
perossidasi del rafano (HRP)
10X (10X).
Diluire 1/10 appena
prima dell'uso
per ottenere una
soluzione di lavoro 1X.
2-8 °C al riparo
dalla luce.
Il coniugato 10X è
stabile no alla data
di scadenza del kit.
Concentrato standard
di proteine di nocciola
3M™
Una ala contenente una
concentrazione di proteina di
nocciola nota.
Fare riferimento
alla sezione
Procedura ELISA
per la preparazione
standard.
2-8 °C. Non
congelare.
Il concentrato
standard di proteine
di nocciola 3M è
stabile no alla data
di scadenza del kit.
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2
Diluente 3M™ (5X) Un acone contenente 50 ml
di diluente 5X.
Diluire 1/5 appena
prima dell'uso
per ottenere una
soluzione di lavoro 1X.
2-8 °C La soluzione diluente
3M 5X è stabile no
alla data di scadenza
del kit.
Soluzione di lavaggio
3M™ (20X)
Un acone contenente 50 ml
di soluzione di lavaggio 20X.
Diluire 1/20 per
ottenere una
soluzione di lavoro 1X.
2-8 °C sia per
la soluzione
di lavoro
1X sia per il
concentrato
di soluzione di
lavaggio 20X.
La soluzione di
lavaggio 3M 20X
è stabile no alla
data di scadenza del
kit. La soluzione di
lavaggio 1X è stabile
per almeno una
settimana in seguito
alla preparazione.
Tampone di
estrazione 3M™ E26
(4X)
Un acone contenente 120
ml di tampone di estrazione
4X.
Diluire 1/4 per
ottenere una
soluzione di lavoro
1X. La soluzione di
lavoro dovrà essere
riscaldata a 50-60 °C
prima dell'uso.
2-8 °C sia per
la soluzione
di lavoro
1X sia per il
concentrato
di tampone di
estrazione 3M
4X.
Il tampone di
estrazione 1X e il
tampone di estrazione
3M 4X sono stabili
no alla data di
scadenza del kit.
Soluzione di substrato
cromogenico 3M™
Un acone
contenente 12 ml di
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina
(TMB).
Pronto all'uso. 2-8 °C al riparo
dalla luce.
Proteggere dalla
luce. La soluzione
di substrato
cromogenico 3M è
stabile no alla data
di scadenza del kit.
Soluzione di arresto
3M™
Un acone contenente 12 ml
di acido solforico 0,3 M.
Pronto all'uso. 2-8 °C La soluzione di
arresto 3M è stabile
no alla data di
scadenza del kit.
Materiali non forniti nel kit:
Pipette di precisione e puntali per pipetta per raccogliere da 10 a 100 l
Provette di test
Lavatrice/aspiratore della piastra di microtitolazione
Acqua distillata o deionizzata
Sistema di lettura per piastre di microtitolazione
Attrezzature da laboratorio assortite per la preparazione di reagenti e soluzioni tampone
• Timer
• Vortex
Sistema a bagnomaria a scuotimento o incubatore a scuotimento
Agitatore orbitale
Sicurezza
L'utente è tenuto a leggere, comprendere e seguire tutte le informazioni per la sicurezza contenute nelle istruzioni
relative al kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M. Conservare le istruzioni di sicurezza per poterle
consultare in futuro.
AVVERTENZA: indica una situazione pericolosa che, se non evitata, potrebbe provocare la morte o lesioni gravi e/o
danni materiali.
AVVISO: indica una situazione potenzialmente pericolosa che, se non evitata, potrebbe provocare danni
materiali.
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3
W AVVERTENZA
Come ridurre i rischi associati all'esposizione a sostanze chimiche:
Smaltire nel rispetto delle normative e degli standard locali/regionali/nazionali/settoriali attualmente in vigore.
L'utente è tenuto a formare il proprio personale alle tecniche di test appropriate attuali, ad esempio le corrette
procedure di laboratorio
1
o la norma ISO/IEC 17025
2
.
Durante la manipolazione di reagenti, seguire sempre le pratiche standard di sicurezza di laboratorio, compreso
l'utilizzo di abbigliamento protettivo e protezioni appropriate per gli occhi.
Evitare il contatto cutaneo con la soluzione di arresto 3M; consultare la scheda di sicurezza per ulteriori
informazioni sulla sicurezza.
Per ridurre i rischi associati a risultati falsi negativi che portano all'emissione di un prodotto contaminato:
Conservare il kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M come indicato sulla confezione e nelle
istruzioni sul prodotto.
Utilizzare il kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M per i campioni alimentari e ambientali che
sono stati validati internamente o da terzi.
Attenersi al protocollo ed eseguire i test esattamente come descritto nelle istruzioni sul prodotto.
3M non ha documentato l'utilizzo del kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M in settori diversi
da quello alimentare e delle bevande. Ad esempio, 3M non ha documentato il presente prodotto per l'analisi su
campioni di tipo farmaceutico, cosmetico, clinico o veterinario.
Per ridurre i rischi associati a risultati inaccurati che portano all'emissione di un prodotto contaminato:
Utilizzare sempre il kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M entro la data di scadenza.
Preparare sempre le soluzioni di lavoro utilizzando i reagenti concentrati del kit ELISA per la rilevazione delle
proteine di nocciola 3M a una temperatura di 20-25 °C.
Non congelare il concentrato standard di proteine di nocciola 3M.
Se la soluzione di substrato cromogenico diventa di colore blu, non utilizzarla. Attenersi alle corrette procedure di
laboratorio
1
per evitare la contaminazione crociata della soluzione di substrato cromogenico 3M.
AVVISO
Per ridurre i rischi associati a risultati non precisi:
La stabilità dei campioni in seguito alle estrazioni non è stata valutata. La procedura ELISA dovrà essere condotta
subito dopo l'estrazione del campione.
Gestire gli standard di proteine di nocciola 3M nel rispetto delle corrette procedure di laboratorio
1
al ne di evitare
la contaminazione crociata dei campioni.
Per ulteriori informazioni, consultare la scheda di sicurezza.
Per informazioni sulla documentazione delle prestazioni del prodotto, visitare il nostro sito Web all'indirizzo
www.3M.com/foodsafety o contattare il distributore o il rappresentante 3M di zona.
Responsabilità dell'utente
Gli utenti sono tenuti a leggere e apprendere le istruzioni e le informazioni sul prodotto. Visitare il sito Web
www.3M.com/foodsafety o contattare il distributore o il rappresentante 3M di zona per ulteriori informazioni.
Analogamente a tutti i metodi di test utilizzati per le analisi alimentari, la matrice del test può inuenzare i risultati.
Nella scelta di un metodo di test, è importante tener conto del fatto che fattori esterni quali i metodi di campionamento,
i protocolli di test, la preparazione del campione, la manipolazione e le tecniche di laboratorio possono inuenzare i
risultati. Lo stesso campione alimentare inuenza i risultati.
È responsabilità dell'utente scegliere l'eventuale metodo o prodotto di test al ne di valutare un numero suciente di
campioni e per confermare che il metodo scelto soddisfa i criteri dell'utente.
L'utente ha inoltre la responsabilità di accertarsi che tutti i metodi di analisi utilizzati e i risultati ottenuti soddisno i
requisiti dei propri clienti e fornitori.
Come per qualsiasi metodo di analisi, i risultati ottenuti grazie al prodotto di sicurezza alimentare 3M non costituiscono
una garanzia della qualità delle matrici o dei processi sottoposti a prova.
Limitazione di garanzia/Rimedio limitato
SALVO NEI CASI ESPRESSAMENTE INDICATI IN UNA SEZIONE DI GARANZIA LIMITATA DELLA SINGOLA CONFEZIONE
DEL PRODOTTO, 3M NON RICONOSCE ALCUNA GARANZIA ESPLICITA O IMPLICITA, INCLUSE, MA NON A ESSE
LIMITATE, LE EVENTUALI GARANZIE DI COMMERCIABILITÀ O DI IDONEITÀ A UNO SCOPO PARTICOLARE.
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Qualora un prodotto 3M Sicurezza alimentare sia difettoso, 3M o il suo distributore autorizzato provvederanno, a loro
discrezione, alla sostituzione o al rimborso del prezzo d'acquisto del prodotto. Questi sono gli unici rimedi a disposizione del
cliente. Si dovrà avvisare immediatamente 3M entro sessanta giorni dal riscontro di eventuali difetti sospetti nel prodotto,
provvedendo a rispedirlo a 3M. Chiamare il servizio clienti (negli USA: 1-800-328-1671) o rivolgersi al rappresentante
autorizzato della Sicurezza alimentare 3M per ottenere l'Autorizzazione alla restituzione del prodotto.
Limitazione di responsabilità da parte di 3M
3M NON SARÀ RESPONSABILE DI PERDITE O DANNI, DIRETTI, INDIRETTI, SPECIALI, INCIDENTALI O EMERGENTI,
INCLUSA, MA NON IN VIA STRETTAMENTE LIMITATIVA, LA PERDITA DI PROFITTO. In nessun caso la responsabilità
legale di 3M andrà oltre il prezzo d'acquisto del prodotto presunto difettoso.
Conservazione e smaltimento
Conservare il contenuto del kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M a 2-8 °C. Non congelare.
Conservare le soluzioni di lavoro diluite come descritto nella Tabella 1.
I componenti del kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M non devono essere utilizzati oltre la data di
scadenza. La data di scadenza e il numero di lotto sono riportati sull'etichetta esterna della scatola.
Smaltire nel rispetto delle normative e degli standard locali/regionali/nazionali/settoriali attualmente in vigore.
Istruzioni per l'uso
Seguire attentamente tutte le istruzioni. In caso contrario, si rischia di ottenere risultati non precisi.
Preparazione dei reagenti
Prima dell'uso, portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (20-25 °C). Utilizzare attrezzature da laboratorio pulite
per diluire e conservare le soluzioni di lavoro.
a. Tampone di estrazione 3M
Per preparare il tampone di estrazione 1X, aggiungere una parte di tampone di estrazione 3M (4X) e diluirlo in
tre parti di acqua deionizzata o distillata. Prima dell'uso, preriscaldare il tampone di estrazione (1X) a 50-60 °C
in un sistema a bagnomaria o in un incubatore a scuotimento. Ciascun campione richiede 4,5 ml di tampone di
estrazione 1X.
b. Soluzione diluente 3M
Per preparare la soluzione diluente 1X, aggiungere una parte di diluente 3M (5X) a quattro parti di acqua
deionizzata o distillata. Ciascun campione richiede un totale di 4,5 ml di soluzione diluente 1X.
c. Soluzione di lavaggio 3M
Per preparare la soluzione di lavaggio 1X, aggiungere una parte di soluzione di lavaggio 3M (20X) a 19 parti di
acqua deionizzata o distillata. Ciascun pozzetto ELISA 3M richiede circa 2,5 ml di soluzione di lavaggio 1X.
Nota: quando la soluzione di lavaggio 3M (20X) viene conservata a 2-8 °C, al suo interno potrebbe vericarsi
la formazione di cristalli. Per dissolvere i cristalli, riscaldare la soluzione di lavaggio 3M (20X) a 30-35 °C in un
sistema a bagnomaria o in un incubatore prima di preparare la soluzione di lavaggio (1X).
d. Coniugato HRP di nocciola 3M
Per preparare il coniugato HRP di nocciola 1X, aggiungere una parte di coniugato HRP di nocciola 3M (10X) e
diluirla in 9 parti di soluzione diluente 1X. Preparare subito prima dell'uso. Ciascun pozzetto ELISA 3M richiede
100 l di coniugato HRP di nocciola 1X.
Preparazione del campione
Nota: tutti i campioni devono essere estratti con il tampone di estrazione 1X preriscaldato a 50-60 °C.
1.1 Preparare il campione per l'estrazione delle proteine in una provetta da test pulita o in una provetta monouso, come
descritto nella Tabella 2.
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Tabella 2. Preparazione del campione
Matrice campione Dimensione
campione
Diluizione (1/10)
Cibi solidi 0,5 ± 0,02 g Aggiungere 4,5 ± 0,09 ml di tampone di estrazione 1X
preriscaldato
Cibi liquidi 0,5 ± 0,01 ml Aggiungere 4,5 ± 0,09 ml di tampone di estrazione 1X
preriscaldato
Acqua di risciacquo nale nei processi
Clean in Place (CIP)
0,5 ± 0,01 ml Aggiungere 4,5 ± 0,09 ml di tampone di estrazione 1X
preriscaldato
Solido
Liquido
1.2 Incubare i campioni diluiti in un sistema a bagnomaria a scuotimento o in un incubatore a scuotimento a 50-60 °C
per 25 ± 1 minuto. In alternativa, è possibile lasciare i campioni in un sistema a bagnomaria o in un incubatore a
50-60 °C e agitarli manualmente per 1 minuto ogni 5 minuti.
1.3 Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni a 5000-7000 rpm (3000 x g) per 20-30 secondi in particelle circolari
o lasciarli riposare per 5 minuti in una rastrelliera di provette da test.
1.4 Raccogliere 100 l di strato (acquoso) intermedio e aggiungerli a 900 l di soluzione diluente (1X). Agitare mediante
vortex o scuotere per mescolare a fondo (questo processo corrisponde a una diluizione di 1/100 del campione originale).
o
50-60 °C
00:25:00
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o
3000 g/00:00:30
00:05:00
Procedura ELISA
2.1 Rimuovere un pozzetto ELISA 3M per campione e/o standard e posizionare i pozzetti nel portapozzetti. Riporre i
pozzetti ELISA 3M nel sacchetto d'alluminio, quindi risigillare quest'ultimo e conservarlo nuovamente a 2-8 °C.
2.2 Utilizzando il concentrato standard di proteine di nocciola 3M, preparare un set di cinque standard diluiti nella
soluzione diluente (1X).
Numero standard Concentrazione standard
(ng/ml)
Volume dello standard
aggiunto a diluente 1X
Volume della soluzione
diluente 1X
5 810 10 l del concentrato standard
di proteine di nocciola 3M
990 µl
4 270 200 l di standard numero 5 400 µl
3 90 200 l di standard numero 4 400 µl
2 30 200 l di standard numero 3 400 µl
1 10 200 l di standard numero 2 400 µl
0 0 0 400 l
2.3 Pipettare 100 l di ciascuno standard nei pozzetti ELISA 3M.
Standard 0 (soluzione diluente 1X)
Standard 1 (10 ng/ml) ppb
Standard 2 (30 ng/ml) ppb
Standard 3 (90 ng/ml) ppb
Standard 4 (270 ng/ml) ppb
Standard 5 (810 ng/ml) ppb
2.4 Pipettare 100 l del campione estratto preparato nel passaggio 1.4 in un pozzetto ELISA 3M.
2.5 Incubare pozzetti ELISA 3M su un set di agitatori orbitali a 400 rpm a temperatura ambiente (20-25 °C) per 30 ± 2
minuti. Durante questa fase, mantenere i pozzetti coperti e diritti al ne di evitare la relativa evaporazione.
2.6 Dopo l'incubazione, aspirare il contenuto dei pozzetti ELISA 3M.
2.7 Riempire completamente ciascun pozzetto ELISA 3M con la soluzione di lavaggio 1X, quindi procedere con
l'aspirazione. Se il lavaggio viene eseguito manualmente, invertire la piastra e versare/agitare il relativo contenuto
in un contenitore per riuti, quindi sbattere energicamente i pozzetti su un panno di carta assorbente al ne di
rimuovere la soluzione di lavaggio residua. Ripetere questo passaggio per tre volte per un totale di quattro lavaggi.
2.8 Pipettare 100 l di coniugato HRP di nocciola 1X in ciascun pozzetto ELISA 3M. Incubare su un set di agitatori
orbitali a 400 rpm a temperatura ambiente per 10 ± 2 minuti. Durante questa fase, mantenere la piastra coperta al
riparo dalla luce e in posizione diritta.
2.9 Ripetere i passaggi 2.6 e 2.7 per completare un totale di quattro lavaggi con la soluzione di lavaggio (1X).
2.10 Pipettare 100 l di soluzione di substrato cromogenico 3M (TMB) in ciascun pozzetto ELISA 3M.
2.11 Incubare su un set di agitatori orbitali a 400 rpm a temperatura ambiente per 10 minuti. Durante questa fase,
mantenere la piastra coperta al riparo dalla luce e in posizione diritta.
2.12 Dopo l'incubazione, aggiungere 100 l di soluzione di arresto 3M a ciascun pozzetto ELISA 3M e determinare
l'assorbanza (a 450 nm) nell'arco di 30 minuti.
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00:30:00/temperatura ambiente
00:10:00/temperatura ambiente
00:10:00/temperatura ambiente
Analisi dei risultati
3.1 Sottrarre il valore di fondo medio per ciascun campione (la lettura dell'assorbanza media del campione meno la
lettura dell'assorbanza media dello zero standard).
3.2 Utilizzando un software per computer in grado di generare una curva di compensazione logistica a quattro
parametri, costruire una curva standard scrivendo la concentrazione in ng/ml (ppb) sull'asse x e la lettura
dell'assorbanza su ognuno degli standard corrispondenti sull'asse y. È inoltre possibile utilizzare accoppiamenti
polinomiali (quadratici) di secondo ordine o altre curve di compensazione; tuttavia, essi forniranno una
rappresentazione dei dati meno precisa.
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3.3 Calcolare le concentrazioni del campione a partire dalla curva standard; l'unità risultante sarà espressa in
ng/ml (ppb). Quindi, moltiplicare per il fattore di diluizione del campione al ne di ottenere la concentrazione del
campione originale. Se, ad esempio, la diluizione totale del campione è 1/100 e la concentrazione del campione
sulla curva standard è 200 ng/ml (ppb), la concentrazione del campione nale sarà 200 ng/ml x 100 = 20.000
ng/ml (ppb), ossia 20 g/ml (ppm).
Caratteristiche minime di funzionamento
a. Il limite di rilevazione (LOD) analitico è 1,9 ng/ml (ppb)
Il limite di rilevazione è denito come la concentrazione minima dell'allergene in un campione di test che può essere
distinto da un campione vuoto a un livello di probabilità specicato
3
. Esso è determinato aggiungendo tre deviazioni
standard al valore di densità ottica medio di trentasei replicati zero standard e calcolando la concentrazione
corrispondente.
b. Il limite di quanticazione (LOQ) è 1 ppm
Il limite di quanticazione è denito come il livello minimo dell'allergene in un campione di test che può essere
ragionevolmente quanticato a un livello di precisione specicato
3
.
Precisione
Precisione nell'ambito dello stesso
dosaggio
% di CV media = <10 N=12
Precisione tra un dosaggio e l'altro % di CV media = <10 N=12
Specicità e reattività crociata
Questa analisi riconosce la proteina di nocciola ed è stata testata prendendo come riferimento diversi campioni per la
valutazione della reattività crociata (Tabella 3).
Tabella 3. Reattività crociata del kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M.
Campione matrice % di reattività crociata
Farina di mandorle <1%
Latte di mandorla <1%
BLG <1%
Noce brasiliana <1%
Farina di grano saraceno <1%
Caseina bovina <1%
Latte bovino <1%
Anacardo <1%
Sedano <1%
Cece <1%
Farina di cocco <1%
Latte di cocco <1%
Farina di mais <1%
Parvalbumina del pesce <1%
Nocciola (+)
Fagiolo di Lima <1%
Noce macadamia <1%
Seme di senape <1%
Ovomucoide <1%
Estratto di piselli <1%
Farina di arachidi <1%
Noce pecan <1%
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3M Allergen Protein ELISA Kit Istruzioni per l'uso

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