3M Allergen Protein ELISA Kit Istruzioni per l'uso

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Data di pubblicazione: 2017-11

Istruzioni sul prodotto

Kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola

Analisi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per l'analisi quantitativa delle proteine di nocciola.

Descrizione del prodotto e uso previsto

Il kit ELISA 3M™ per la rilevazione delle proteine di nocciola è indicato per la rilevazione delle proteine di nocciola

nell'acqua di risciacquo nale nei processi Clean in Place (CIP), nei campioni di tamponi ambientali, negli ingredienti

alimentari e nei prodotti alimentari trattati.

Il kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M utilizza un ELISA a sandwich. Le proteine di nocciola

presenti nel campione reagiscono con l'anticorpo anti-nocciola, il quale è stato assorbito dalla supercie dei pozzetti

di microtitolazione in polistirene. In seguito alla rimozione di proteine non legate tramite il lavaggio, vengono aggiunti

anticorpi anti-nocciola coniugati a perossidasi del rafano (HRP). Questi anticorpi enzimatici formano complessi con la

proteina di nocciola precedentemente legata. In seguito a una seconda fase di lavaggio, l'enzima legato all'immuno-

assorbente viene rilevato tramite l'aggiunta di un substrato cromogenico, la 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). Lo

sviluppo di colori derivante da questa reazione enzimatica varia a seconda della concentrazione di proteina di nocciola

nel campione testato; pertanto, l'assorbanza, a 450 nm, è una misura della concentrazione di proteina di nocciola nel

campione di test. La quantità di proteina di nocciola presente nel campione di test può essere estrapolata dalla curva

standard, costruita dagli standard della concentrazione nota e regolata al ne di considerare la diluizione del campione.

Il kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M deve essere utilizzato in laboratorio da professionisti che

conoscono le tecniche di laboratorio. 3M non ha documentato l'utilizzo del presente prodotto in settori diversi da quello

alimentare e delle bevande. Ad esempio, 3M non ha documentato il presente prodotto per l'analisi su campioni di tipo

farmaceutico, cosmetico, clinico o veterinario. Il kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M non è stato

valutato con tutti i prodotti alimentari, i processi alimentari e i protocolli di test possibili.

Il kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M contiene 96 pozzetti, descritti nella Tabella 1.

Tabella 1. Componenti del kit

Articolo Identicazione Preparazione

(consultare la sezione

Preparazione dei

reagenti per maggiori

dettagli)

Conservazione Stabilità

Pozzetti ELISA 3M™

per la rilevazione delle

proteine di nocciola

Una sacca di alluminio con

una piastra di 96 pozzetti

rimovibili rivestiti di

anticorpi.

Pronto all'uso. 2-8 °C nella

sacca di

alluminio

sigillata con

essiccante.

Sacca di alluminio

risigillabile

contenente

essiccante e

pozzetti inutilizzati.

Conservare a 2-8 °C

per mantenere una

stabilità adeguata no

alla data di scadenza

del kit.

Coniugato HRP di

nocciola 3M™ (10X)

Una ala contenente 1,5 ml

di anticorpo coniugato a

perossidasi del rafano (HRP)

10X (10X).

Diluire 1/10 appena

prima dell'uso

per ottenere una

soluzione di lavoro 1X.

2-8 °C al riparo

dalla luce.

Il coniugato 10X è

stabile no alla data

di scadenza del kit.

Concentrato standard

di proteine di nocciola

3M™

Una ala contenente una

concentrazione di proteina di

nocciola nota.

Fare riferimento

alla sezione

Procedura ELISA

per la preparazione

standard.

2-8 °C. Non

congelare.

Il concentrato

standard di proteine

di nocciola 3M è

stabile no alla data

di scadenza del kit.

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Diluente 3M™ (5X) Un acone contenente 50 ml

di diluente 5X.

Diluire 1/5 appena

prima dell'uso

per ottenere una

soluzione di lavoro 1X.

2-8 °C La soluzione diluente

3M 5X è stabile no

alla data di scadenza

del kit.

Soluzione di lavaggio

3M™ (20X)

Un acone contenente 50 ml

di soluzione di lavaggio 20X.

Diluire 1/20 per

ottenere una

soluzione di lavoro 1X.

2-8 °C sia per

la soluzione

di lavoro

1X sia per il

concentrato

di soluzione di

lavaggio 20X.

La soluzione di

lavaggio 3M 20X

è stabile no alla

data di scadenza del

kit. La soluzione di

lavaggio 1X è stabile

per almeno una

settimana in seguito

alla preparazione.

Tampone di

estrazione 3M™ E26

(4X)

Un acone contenente 120

ml di tampone di estrazione

4X.

Diluire 1/4 per

ottenere una

soluzione di lavoro

1X. La soluzione di

lavoro dovrà essere

riscaldata a 50-60 °C

prima dell'uso.

2-8 °C sia per

la soluzione

di lavoro

1X sia per il

concentrato

di tampone di

estrazione 3M

4X.

Il tampone di

estrazione 1X e il

tampone di estrazione

3M 4X sono stabili

no alla data di

scadenza del kit.

Soluzione di substrato

cromogenico 3M™

Un acone

contenente 12 ml di

3,3',5,5'-tetrametilbenzidina

(TMB).

Pronto all'uso. 2-8 °C al riparo

dalla luce.

Proteggere dalla

luce. La soluzione

di substrato

cromogenico 3M è

stabile no alla data

di scadenza del kit.

Soluzione di arresto

3M™

Un acone contenente 12 ml

di acido solforico 0,3 M.

Pronto all'uso. 2-8 °C La soluzione di

arresto 3M è stabile

no alla data di

scadenza del kit.

Materiali non forniti nel kit:

• Pipette di precisione e puntali per pipetta per raccogliere da 10 a 100 l

• Provette di test

• Lavatrice/aspiratore della piastra di microtitolazione

• Acqua distillata o deionizzata

• Sistema di lettura per piastre di microtitolazione

• Attrezzature da laboratorio assortite per la preparazione di reagenti e soluzioni tampone

• Timer

• Vortex

• Sistema a bagnomaria a scuotimento o incubatore a scuotimento

• Agitatore orbitale

Sicurezza

L'utente è tenuto a leggere, comprendere e seguire tutte le informazioni per la sicurezza contenute nelle istruzioni

relative al kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M. Conservare le istruzioni di sicurezza per poterle

consultare in futuro.

AVVERTENZA: indica una situazione pericolosa che, se non evitata, potrebbe provocare la morte o lesioni gravi e/o

danni materiali.

AVVISO: indica una situazione potenzialmente pericolosa che, se non evitata, potrebbe provocare danni

materiali.

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W AVVERTENZA

Come ridurre i rischi associati all'esposizione a sostanze chimiche:

• Smaltire nel rispetto delle normative e degli standard locali/regionali/nazionali/settoriali attualmente in vigore.

• L'utente è tenuto a formare il proprio personale alle tecniche di test appropriate attuali, ad esempio le corrette

procedure di laboratorio

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o la norma ISO/IEC 17025

2

.

• Durante la manipolazione di reagenti, seguire sempre le pratiche standard di sicurezza di laboratorio, compreso

l'utilizzo di abbigliamento protettivo e protezioni appropriate per gli occhi.

• Evitare il contatto cutaneo con la soluzione di arresto 3M; consultare la scheda di sicurezza per ulteriori

informazioni sulla sicurezza.

Per ridurre i rischi associati a risultati falsi negativi che portano all'emissione di un prodotto contaminato:

• Conservare il kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M come indicato sulla confezione e nelle

istruzioni sul prodotto.

• Utilizzare il kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M per i campioni alimentari e ambientali che

sono stati validati internamente o da terzi.

• Attenersi al protocollo ed eseguire i test esattamente come descritto nelle istruzioni sul prodotto.

• 3M non ha documentato l'utilizzo del kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M in settori diversi

da quello alimentare e delle bevande. Ad esempio, 3M non ha documentato il presente prodotto per l'analisi su

campioni di tipo farmaceutico, cosmetico, clinico o veterinario.

Per ridurre i rischi associati a risultati inaccurati che portano all'emissione di un prodotto contaminato:

• Utilizzare sempre il kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M entro la data di scadenza.

• Preparare sempre le soluzioni di lavoro utilizzando i reagenti concentrati del kit ELISA per la rilevazione delle

proteine di nocciola 3M a una temperatura di 20-25 °C.

• Non congelare il concentrato standard di proteine di nocciola 3M.

• Se la soluzione di substrato cromogenico diventa di colore blu, non utilizzarla. Attenersi alle corrette procedure di

laboratorio

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per evitare la contaminazione crociata della soluzione di substrato cromogenico 3M.

AVVISO

Per ridurre i rischi associati a risultati non precisi:

• La stabilità dei campioni in seguito alle estrazioni non è stata valutata. La procedura ELISA dovrà essere condotta

subito dopo l'estrazione del campione.

• Gestire gli standard di proteine di nocciola 3M nel rispetto delle corrette procedure di laboratorio

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al ne di evitare

la contaminazione crociata dei campioni.

Per ulteriori informazioni, consultare la scheda di sicurezza.

Per informazioni sulla documentazione delle prestazioni del prodotto, visitare il nostro sito Web all'indirizzo

www.3M.com/foodsafety o contattare il distributore o il rappresentante 3M di zona.

Responsabilità dell'utente

Gli utenti sono tenuti a leggere e apprendere le istruzioni e le informazioni sul prodotto. Visitare il sito Web

www.3M.com/foodsafety o contattare il distributore o il rappresentante 3M di zona per ulteriori informazioni.

Analogamente a tutti i metodi di test utilizzati per le analisi alimentari, la matrice del test può inuenzare i risultati.

Nella scelta di un metodo di test, è importante tener conto del fatto che fattori esterni quali i metodi di campionamento,

i protocolli di test, la preparazione del campione, la manipolazione e le tecniche di laboratorio possono inuenzare i

risultati. Lo stesso campione alimentare inuenza i risultati.

È responsabilità dell'utente scegliere l'eventuale metodo o prodotto di test al ne di valutare un numero suciente di

campioni e per confermare che il metodo scelto soddisfa i criteri dell'utente.

L'utente ha inoltre la responsabilità di accertarsi che tutti i metodi di analisi utilizzati e i risultati ottenuti soddisno i

requisiti dei propri clienti e fornitori.

Come per qualsiasi metodo di analisi, i risultati ottenuti grazie al prodotto di sicurezza alimentare 3M non costituiscono

una garanzia della qualità delle matrici o dei processi sottoposti a prova.

Limitazione di garanzia/Rimedio limitato

SALVO NEI CASI ESPRESSAMENTE INDICATI IN UNA SEZIONE DI GARANZIA LIMITATA DELLA SINGOLA CONFEZIONE

DEL PRODOTTO, 3M NON RICONOSCE ALCUNA GARANZIA ESPLICITA O IMPLICITA, INCLUSE, MA NON A ESSE

LIMITATE, LE EVENTUALI GARANZIE DI COMMERCIABILITÀ O DI IDONEITÀ A UNO SCOPO PARTICOLARE.

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Qualora un prodotto 3M Sicurezza alimentare sia difettoso, 3M o il suo distributore autorizzato provvederanno, a loro

discrezione, alla sostituzione o al rimborso del prezzo d'acquisto del prodotto. Questi sono gli unici rimedi a disposizione del

cliente. Si dovrà avvisare immediatamente 3M entro sessanta giorni dal riscontro di eventuali difetti sospetti nel prodotto,

provvedendo a rispedirlo a 3M. Chiamare il servizio clienti (negli USA: 1-800-328-1671) o rivolgersi al rappresentante

autorizzato della Sicurezza alimentare 3M per ottenere l'Autorizzazione alla restituzione del prodotto.

Limitazione di responsabilità da parte di 3M

3M NON SARÀ RESPONSABILE DI PERDITE O DANNI, DIRETTI, INDIRETTI, SPECIALI, INCIDENTALI O EMERGENTI,

INCLUSA, MA NON IN VIA STRETTAMENTE LIMITATIVA, LA PERDITA DI PROFITTO. In nessun caso la responsabilità

legale di 3M andrà oltre il prezzo d'acquisto del prodotto presunto difettoso.

Conservazione e smaltimento

Conservare il contenuto del kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M a 2-8 °C. Non congelare.

Conservare le soluzioni di lavoro diluite come descritto nella Tabella 1.

I componenti del kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M non devono essere utilizzati oltre la data di

scadenza. La data di scadenza e il numero di lotto sono riportati sull'etichetta esterna della scatola.

Smaltire nel rispetto delle normative e degli standard locali/regionali/nazionali/settoriali attualmente in vigore.

Istruzioni per l'uso

Seguire attentamente tutte le istruzioni. In caso contrario, si rischia di ottenere risultati non precisi.

Preparazione dei reagenti

Prima dell'uso, portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (20-25 °C). Utilizzare attrezzature da laboratorio pulite

per diluire e conservare le soluzioni di lavoro.

a. Tampone di estrazione 3M

Per preparare il tampone di estrazione 1X, aggiungere una parte di tampone di estrazione 3M (4X) e diluirlo in

tre parti di acqua deionizzata o distillata. Prima dell'uso, preriscaldare il tampone di estrazione (1X) a 50-60 °C

in un sistema a bagnomaria o in un incubatore a scuotimento. Ciascun campione richiede 4,5 ml di tampone di

estrazione 1X.

b. Soluzione diluente 3M

Per preparare la soluzione diluente 1X, aggiungere una parte di diluente 3M (5X) a quattro parti di acqua

deionizzata o distillata. Ciascun campione richiede un totale di 4,5 ml di soluzione diluente 1X.

c. Soluzione di lavaggio 3M

Per preparare la soluzione di lavaggio 1X, aggiungere una parte di soluzione di lavaggio 3M (20X) a 19 parti di

acqua deionizzata o distillata. Ciascun pozzetto ELISA 3M richiede circa 2,5 ml di soluzione di lavaggio 1X.

Nota: quando la soluzione di lavaggio 3M (20X) viene conservata a 2-8 °C, al suo interno potrebbe vericarsi

la formazione di cristalli. Per dissolvere i cristalli, riscaldare la soluzione di lavaggio 3M (20X) a 30-35 °C in un

sistema a bagnomaria o in un incubatore prima di preparare la soluzione di lavaggio (1X).

d. Coniugato HRP di nocciola 3M

Per preparare il coniugato HRP di nocciola 1X, aggiungere una parte di coniugato HRP di nocciola 3M (10X) e

diluirla in 9 parti di soluzione diluente 1X. Preparare subito prima dell'uso. Ciascun pozzetto ELISA 3M richiede

100 l di coniugato HRP di nocciola 1X.

Preparazione del campione

Nota: tutti i campioni devono essere estratti con il tampone di estrazione 1X preriscaldato a 50-60 °C.

1.1 Preparare il campione per l'estrazione delle proteine in una provetta da test pulita o in una provetta monouso, come

descritto nella Tabella 2.

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Tabella 2. Preparazione del campione

Matrice campione Dimensione

campione

Diluizione (1/10)

Cibi solidi 0,5 ± 0,02 g Aggiungere 4,5 ± 0,09 ml di tampone di estrazione 1X

preriscaldato

Cibi liquidi 0,5 ± 0,01 ml Aggiungere 4,5 ± 0,09 ml di tampone di estrazione 1X

preriscaldato

Acqua di risciacquo nale nei processi

Clean in Place (CIP)

0,5 ± 0,01 ml Aggiungere 4,5 ± 0,09 ml di tampone di estrazione 1X

preriscaldato

Solido

Liquido

1.2 Incubare i campioni diluiti in un sistema a bagnomaria a scuotimento o in un incubatore a scuotimento a 50-60 °C

per 25 ± 1 minuto. In alternativa, è possibile lasciare i campioni in un sistema a bagnomaria o in un incubatore a

50-60 °C e agitarli manualmente per 1 minuto ogni 5 minuti.

1.3 Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni a 5000-7000 rpm (3000 x g) per 20-30 secondi in particelle circolari

o lasciarli riposare per 5 minuti in una rastrelliera di provette da test.

1.4 Raccogliere 100 l di strato (acquoso) intermedio e aggiungerli a 900 l di soluzione diluente (1X). Agitare mediante

vortex o scuotere per mescolare a fondo (questo processo corrisponde a una diluizione di 1/100 del campione originale).

o

50-60 °C

00:25:00

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o

3000 g/00:00:30

00:05:00

Procedura ELISA

2.1 Rimuovere un pozzetto ELISA 3M per campione e/o standard e posizionare i pozzetti nel portapozzetti. Riporre i

pozzetti ELISA 3M nel sacchetto d'alluminio, quindi risigillare quest'ultimo e conservarlo nuovamente a 2-8 °C.

2.2 Utilizzando il concentrato standard di proteine di nocciola 3M, preparare un set di cinque standard diluiti nella

soluzione diluente (1X).

Numero standard Concentrazione standard

(ng/ml)

Volume dello standard

aggiunto a diluente 1X

Volume della soluzione

diluente 1X

5 810 10 l del concentrato standard

di proteine di nocciola 3M

990 µl

4 270 200 l di standard numero 5 400 µl

3 90 200 l di standard numero 4 400 µl

2 30 200 l di standard numero 3 400 µl

1 10 200 l di standard numero 2 400 µl

0 0 0 400 l

2.3 Pipettare 100 l di ciascuno standard nei pozzetti ELISA 3M.

• Standard 0 (soluzione diluente 1X)

• Standard 1 (10 ng/ml) ppb

• Standard 2 (30 ng/ml) ppb

• Standard 3 (90 ng/ml) ppb

• Standard 4 (270 ng/ml) ppb

• Standard 5 (810 ng/ml) ppb

2.4 Pipettare 100 l del campione estratto preparato nel passaggio 1.4 in un pozzetto ELISA 3M.

2.5 Incubare pozzetti ELISA 3M su un set di agitatori orbitali a 400 rpm a temperatura ambiente (20-25 °C) per 30 ± 2

minuti. Durante questa fase, mantenere i pozzetti coperti e diritti al ne di evitare la relativa evaporazione.

2.6 Dopo l'incubazione, aspirare il contenuto dei pozzetti ELISA 3M.

2.7 Riempire completamente ciascun pozzetto ELISA 3M con la soluzione di lavaggio 1X, quindi procedere con

l'aspirazione. Se il lavaggio viene eseguito manualmente, invertire la piastra e versare/agitare il relativo contenuto

in un contenitore per riuti, quindi sbattere energicamente i pozzetti su un panno di carta assorbente al ne di

rimuovere la soluzione di lavaggio residua. Ripetere questo passaggio per tre volte per un totale di quattro lavaggi.

2.8 Pipettare 100 l di coniugato HRP di nocciola 1X in ciascun pozzetto ELISA 3M. Incubare su un set di agitatori

orbitali a 400 rpm a temperatura ambiente per 10 ± 2 minuti. Durante questa fase, mantenere la piastra coperta al

riparo dalla luce e in posizione diritta.

2.9 Ripetere i passaggi 2.6 e 2.7 per completare un totale di quattro lavaggi con la soluzione di lavaggio (1X).

2.10 Pipettare 100 l di soluzione di substrato cromogenico 3M (TMB) in ciascun pozzetto ELISA 3M.

2.11 Incubare su un set di agitatori orbitali a 400 rpm a temperatura ambiente per 10 minuti. Durante questa fase,

mantenere la piastra coperta al riparo dalla luce e in posizione diritta.

2.12 Dopo l'incubazione, aggiungere 100 l di soluzione di arresto 3M a ciascun pozzetto ELISA 3M e determinare

l'assorbanza (a 450 nm) nell'arco di 30 minuti.

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00:30:00/temperatura ambiente

00:10:00/temperatura ambiente

Analisi dei risultati

3.1 Sottrarre il valore di fondo medio per ciascun campione (la lettura dell'assorbanza media del campione meno la

lettura dell'assorbanza media dello zero standard).

3.2 Utilizzando un software per computer in grado di generare una curva di compensazione logistica a quattro

parametri, costruire una curva standard scrivendo la concentrazione in ng/ml (ppb) sull'asse x e la lettura

dell'assorbanza su ognuno degli standard corrispondenti sull'asse y. È inoltre possibile utilizzare accoppiamenti

polinomiali (quadratici) di secondo ordine o altre curve di compensazione; tuttavia, essi forniranno una

rappresentazione dei dati meno precisa.

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3.3 Calcolare le concentrazioni del campione a partire dalla curva standard; l'unità risultante sarà espressa in

ng/ml (ppb). Quindi, moltiplicare per il fattore di diluizione del campione al ne di ottenere la concentrazione del

campione originale. Se, ad esempio, la diluizione totale del campione è 1/100 e la concentrazione del campione

sulla curva standard è 200 ng/ml (ppb), la concentrazione del campione nale sarà 200 ng/ml x 100 = 20.000

ng/ml (ppb), ossia 20 g/ml (ppm).

Caratteristiche minime di funzionamento

a. Il limite di rilevazione (LOD) analitico è 1,9 ng/ml (ppb)

Il limite di rilevazione è denito come la concentrazione minima dell'allergene in un campione di test che può essere

distinto da un campione vuoto a un livello di probabilità specicato

3

. Esso è determinato aggiungendo tre deviazioni

standard al valore di densità ottica medio di trentasei replicati zero standard e calcolando la concentrazione

corrispondente.

b. Il limite di quanticazione (LOQ) è 1 ppm

Il limite di quanticazione è denito come il livello minimo dell'allergene in un campione di test che può essere

ragionevolmente quanticato a un livello di precisione specicato

3

.

Precisione

Precisione nell'ambito dello stesso

dosaggio

% di CV media = <10 N=12

Precisione tra un dosaggio e l'altro % di CV media = <10 N=12

Specicità e reattività crociata

Questa analisi riconosce la proteina di nocciola ed è stata testata prendendo come riferimento diversi campioni per la

valutazione della reattività crociata (Tabella 3).

Tabella 3. Reattività crociata del kit ELISA per la rilevazione delle proteine di nocciola 3M.

Campione matrice % di reattività crociata

Farina di mandorle <1%

Latte di mandorla <1%

BLG <1%

Noce brasiliana <1%

Farina di grano saraceno <1%

Caseina bovina <1%

Latte bovino <1%

Anacardo <1%

Sedano <1%

Cece <1%

Farina di cocco <1%

Latte di cocco <1%

Farina di mais <1%

Parvalbumina del pesce <1%

Nocciola (+)

Fagiolo di Lima <1%

Noce macadamia <1%

Seme di senape <1%

Ovomucoide <1%

Estratto di piselli <1%

Farina di arachidi <1%

Noce pecan <1%

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