Thermo Fisher Scientific Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Manuale del proprietario

Applied Biosystems StepOne™

Real-Time PCR System

Guida reagenti

Applied Biosystems StepOne™

Real-Time PCR System

Guida reagenti

RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

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The StepOne™ Real-Time PCR System is covered by US patents and corresponding claims in their non-US counterparts, owned by Applied Biosystems.

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StepOne, TAMRA, and TET are trademarks of Applied Biosystems or its subsidiaries in the U.S. and/or certain other countries.

AmpErase, AmpliTaq Gold, and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc.

SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc.

All other trademarks are the sole property of their respective owners.

N. di cat. 4377717 Rev. B

06/2010

Indice Front Cover

iiiGuida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

CONFIDENTIAL — For AB Internal Use Only. Do Not Distribute.

Premessa

Come utilizzare questa guida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii

Come ottenere ulteriori informazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix

Come ottenere assistenza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi

Capitolo 1 Introduzione

Informazioni sul sistema StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2

Preparazione degli esperimenti sul sistema StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4

Selezione del tipo di esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-5

Selezione del tipo di reagente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-6

Selezione del tipo di saggio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-7

Capitolo 2 Descrizione generale dei reagenti

Descrizione generale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2

Reagenti TaqMan® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2

Reagenti SYBR® Green . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-4

Selezione del tipo di reagente appropriato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-6

Riduzione al minimo delle contaminazione da DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-8

Capitolo 3 Esperimenti di quantificazione

Sezione 3.1: Informazioni sugli esperimenti di quantificazione . . . . . . . . . . . . . . . . 3-3

Descrizione generale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-4

Selezione di un metodo di quantificazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5

Selezione della RT-PCR one-step o two-step . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-8

Selezione PCR singleplex o multiplex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10

Selezione del tipo di reagente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13

Selezione del tipo di saggio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13

Sezione 3.2: Linee guida disegno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-17

Saggi inventariati/prodotti su ordine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18

Saggi di espressione genica TaqMan® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18

Saggi di espressione genica TaqMan® personalizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-20

Selezione della Master Mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-21

Disegno dell'esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22

iv Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

CONFIDENTIAL — For AB Internal Use Only. Do Not Distribute.

Saggi personalizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22

Disegno dei primer e delle sonde utilizzando il software Primer Express® . . . . . . 3-23

Selezione dei reagenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-25

Utilizzo delle condizioni di ciclo termico raccomandate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-27

Ottimizzazione delle concentrazioni primer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-30

Ottimizzazione della concentrazione della sonda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-34

Per ulteriori informazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-36

Capitolo 4 Esperimenti di genotipizzazione

Sezione 4.1: Informazioni sugli esperimenti di genotipizzazione . . . . . . . . . . . . . . . 4-3

Descrizione generale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-4

Selezione del tipo di saggio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-6

Sezione 4.2: Linee guida disegno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-9

Saggi pre-disegnati/convalidati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10

Saggi genotipizzazione SNP TaqMan® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10

Saggi genotipizzazione del metabolismo di farmaci TaqMan® . . . . . . . . . . . . . . . 4-11

Reagenti per i saggi pre-sviluppati TaqMan® per discriminazione allelica . . . . . . 4-12

Selezione della Master Mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-13

Disegno dell'esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14

Saggi personalizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14

Saggi di genotipizzazione SNP TaqMan® personalizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-15

Selezione della Master Mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-16

Disegno dell'esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-17

Capitolo 5 Esperimenti di presenza/assenza

Sezione 5.1: Informazioni sugli esperimenti di presenza/assenza . . . . . . . . . . . . . . 5-3

Descrizione generale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-4

Selezione del tipo di saggio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-5

Sezione 5.2: Linee guida disegno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-9

Saggi inventariati/prodotti su ordine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10

Saggi di espressione genica TaqMan® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10

Saggi di espressione genica TaqMan® personalizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-12

Reagenti di controllo positivo interno esogeno TaqMan® . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-13

Selezione della Master Mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-14

Disegno dell'esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-15

Saggi personalizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-15

vGuida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

CONFIDENTIAL — For AB Internal Use Only. Do Not Distribute.

Appendice A Formula

Formula per esperimenti con CT comparativo (ΔΔCT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-1

Appendice B Limitazione dei primer nella PCR multiplex

Appendice C Linee guida disegno saggi

Bibliografia

Glossario

Indice

vi Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

CONFIDENTIAL — For AB Internal Use Only. Do Not Distribute.

viiGuida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Premessa

Come utilizzare questa guida

Scopo della

guida

La guida fornisce le informazioni sui reagenti che è possibile utilizzare sul sistema

PCR Real-Time StepOne™ Applied Biosystems (sistema StepOne™). Informazioni

contenute nella guida:

• Introduzione ai reagenti TaqMan® e SYBR® Green

• Descrizioni e linee guida disegno per i seguenti tipi di esperimento:

– Esperimenti di quantificazione

– Esperimenti di genotipizzazione

– Esperimenti di presenza/assenza

A chi si rivolge Questa guida è pubblicata per il personale di laboratorio e per i ricercatori principali

che eseguono esperimenti con curva standard con il sistema StepOne.

Ipotesi assunte La guida prevede che l'utente:

• Abbia una conoscenza professionale del processo della reazione a catena della

polimerasi (PCR).

• Conosca le modalità di manipolazione dei campioni DNA e/o RNA e della loro

preparazione per la PCR.

Convenzioni

del testo

La guida utilizza le seguenti convenzioni:

• Il testo in Grassetto indica un azione dell'utente. Ad esempio:

Digitare 0, quindi premere Enter (Invio) per ognuno dei campi rimanenti.

• Il testo in Corsivo indica parole nuove o importanti e viene utilizzato anche per

enfatizzare. Ad esempio:

Prima di un'analisi, preparare sempre matrice fresca.

• Un simbolo di freccia a destra () separa i comandi successivi selezionati da un

menu a discesa o da un menu a scelta rapida. Ad esempio:

Selezionare FileOpen (Apri).

viii Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Premessa

Messaggi di

attenzione per

l'utente

Nella documentazione per l'utente Applied Biosystems compaiono due tipi di

messaggi di attenzione. Ciascun messaggio presuppone un particolare livello di

osservanza o l'esecuzione di una particolare operazione da parte dell'utente, secondo

quanto descritto qui di seguito:

Nota: – Fornisce informazioni che potrebbero essere di interesse o di aiuto ma non

di importanza critica per l'uso del prodotto.

IMPORTANTE! – Fornisce informazioni necessarie per il corretto funzionamento

dello strumento, per l'uso accurato del kit reagenti o per l'uso sicuro di un prodotto

chimico.

Alcuni esempi dei messaggi di attenzione sono indicati qui di seguito:

Nota: La funzione Calibrate (Calibra) è anche disponibile nella Control Console

(Console di comando).

IMPORTANTE! Per verificare la propria connessione client, è necessario un ID

utente valido.

Messaggi di

sicurezza

Nella documentazione per l'utente di Applied Biosystems appaiono quattro diversi

messaggi di attenzione in punti del documento dove risulta necessario essere ben

consapevoli della possibilità di pericoli rilevanti. Ciascun

messaggio—IMPORTANTE, ATTENZIONE, AVVERTENZA,

PERICOLO—presuppone un particolare livello di osservanza o l'esecuzione di una

particolare operazione da parte dell'utente, secondo quanto descritto qui di seguito.

Definizioni

IMPORTANTE! – Indica informazioni necessarie per il corretto funzionamento dello

strumento, per l'uso accurato del kit reagenti o per l'uso sicuro di un prodotto

chimico.

– Indica una situazione potenzialmente pericolosa che, se non

evitata, potrebbe causare lesioni di minore o moderata entità. Può inoltre essere

utilizzata per mettere in guardia l'utente nei confronti di pratiche non sicure.

– Indica una situazione potenzialmente pericolosa che, se non

evitata, potrebbe causare lesioni gravi o morte.

– Indica una situazione di pericolo incombente che, se non evitata,

causerà morte o lesioni gravi. Questo messaggio viene utilizzato esclusivamente

nelle situazioni di estremo pericolo.

Ad eccezione di IMPORTANTE, ogni messaggio di sicurezza in un documento

Applied Biosystems appare accanto a un figura di triangolo aperto contenente un

simbolo di pericolo. Questi simboli di pericolo sono identici a quelli posizionati sugli

strumenti Applied Biosystems.

ixGuida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

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Premessa

Esempi

IMPORTANTE! Creare un foglio elettronico separato di immissione campioni per

ogni piastra di reazione a 96-pozzetti.

PERICOLO CHIMICO. TaqM an® Universal PCR Master

Mix può provocare irritazione degli occhi e della pelle. L'esposizione può provocare

problemi in caso di ingestione o inalazione. Leggere la scheda di sicurezza dei

materiali (MSDS) e attenersi rigorosamente alle istruzioni relative alla

manipolazione di questa sostanza. Indossare un'adeguata protezione oculare,

indumenti e guanti di protezione.

PERICOLO DI INFORTUNIO. Durante il funzionamento

dello strumento, il pannello di copertura riscaldato e il blocco campione possono

raggiungere temperature che superano anche i 100 °C.

PERICOLO ELETTRICO. La continuità del circuito di messa a

terra è vitale per il funzionamento in sicurezza. Non mettere mai in funzione il

sistema con il conduttore di messa a terra scollegato.

Come ottenere ulteriori informazioni

Documentazione

correlata

La documentazione seguente è allegata al sistema StepOne:

Documento n. di cat.

inglese

n. di cat.

italiano

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting

Started Guide for Genotyping Experiments

4376786

4377729

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting

Started Guide for Presence/Absence Experiments 4376787

—

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting

Started Guide for Relative Standard Curve and Comparative CT

Experiments

4376785

4377742

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting

Started Guide for Standard Curve Experiments

4376784

4377736

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Installation, Maintenance, and Networking Guide

4376782

4377798

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Installation Quick Reference Card

4376783

4377792

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Site

Preparation Guide

4376768

4378359

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software

Help

—

xGuida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

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Premessa

La documentazione di supporto seguente è disponibile presso Applied Biosystems:

Nota: Per ulteriori documentazioni, consultare “Come ottenere assistenza” a

pagina xi.

Informazioni dalla

Guida Software

(Help)

La Guida (Help) software del sistema PCR Real-Time StepOne™ Applied

Biosystems (software StepOne™) descrive la modalità di utilizzo di ogni funzione

dell'interfaccia utente. Accedere alla voce Help (Guida) dal software StepOne in uno

dei modi seguenti:

• Premere F1.

• Fare clic su nella barra degli strumenti.

• Selezionare Help (Guida)StepOne Help (Guida StepOne).

Documento n. di cat.

Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol 4375575

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation

Performance Verification Protocol

4376791

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation

Qualification-Operation Qualification Protocol

4376790

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Planned Maintenance

Protocol

4376788

Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol 4334429

Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines 4367671

Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol 4334431

Power SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol 4367218

Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol 4312214

Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide 4362460

SYBR® Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol 4304965

SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol 4310251

TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol 4362038

TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol 4308335

TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol 4351891

TaqMan® Gene Expression Assays Protocol 4333458

TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol 4332856

TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol 4304449

User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression 4303859

Using TaqMan® Endogenous Control Assays to Select an Endogenous

Control for Experimental Studies Application Note

127AP08

xiGuida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Premessa

Per trovare argomenti di interesse nella voce Help (Guida):

• Esaminare l'indice.

• Cercare un argomento specifico.

• Cercare un indice alfabetico.

Invio di commenti Applied Biosystems è lieta di ricevere i commenti e i suggerimenti dei clienti allo

scopo di migliorare la propria documentazione per l'utente. È possibile inviare

commenti tramite e-mail a:

[email protected]

IMPORTANTE! Utilizzare l'indirizzo e-mail sopra indicato esclusivamente per

inoltrare commenti e suggerimenti relativi alla documentazione. Per ordinare

documenti, scaricare file PDF o per aiuto su questioni tecniche, visitare il sito web

all'indirizzo http://www.appliedbiosystems.com, quindi fare clic sul link per il

Support (assistenza). (Vedere “Come ottenere assistenza” qui di seguito).

Come ottenere assistenza

Per le informazioni relative a servizi e assistenza tecnica più recenti per tutte le sedi,

visitare il sito web all'indirizzo http://www.appliedbiosystems.com, quindi fare clic

sul link Support.

Nella pagina dell'assistenza clienti, è possibile:

• Ricercare argomenti attraverso le domande frequenti (FAQ)

• Inviare una domanda direttamente al servizio di assistenza tecnica

• Ordinare documenti per l'utente Applied Biosystems, MSDS, certificati di

analisi e altri documenti correlati

• Scaricare documenti in PDF

• Ottenere informazioni sull'addestramento del cliente

• Scaricare aggiornamenti e patch del software

Inoltre, la pagina dell'assistenza clienti fornisce l'accesso ai numeri di telefono e di

fax in tutto il mondo per contattare l'assistenza tecnica e i punti vendita

Applied Biosystems.

IMPORTANTE! Contattare il Servizio clienti Applied Biosystems (Customer Care

Center) quando suggerito da questa guida o in caso di necessità per programmare le

operazioni di manutenzione (quali, manutenzione pianificata annuale o

verifica/calibrazione della temperatura) per il proprio strumento StepOne™.

Per ottenere un numero di telefono o un indirizzo e-mail del servizio clienti, andare

su http://www.appliedbiosystems.com/support/contact.

xii Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Premessa

1-1Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

1

Introduzione 1

Questo capitolo comprende i paragrafi:

Informazioni sul sistema StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2

Preparazione degli esperimenti sul sistema StepOne™. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4

Selezione del tipo di esperimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-5

Selezione del tipo di reagente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-6

Selezione del tipo di saggio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-7

1-2 Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

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Capitolo 1 Introduzione

Informazioni sul sistema StepOne™

Il sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System (sistema

StepOne™) utilizza reagenti fluorescenti della reazione a catena della polimerasi

(PCR) per fornire:

• Rilevamento quantitativo delle sequenze target dell'acido nucleico (target)

utilizzando l'analisi in tempo reale.

• Rilevamento qualitativo delle sequenze target dell'acido nucleico (target)

utilizzando analisi end-point e con curva di melting.

Informazioni

sull'acquisizione

dei dati

Il sistema StepOne acquisisce dati di fluorescenza non elaborati in punti diversi

durante una PCR, in dipendenza del tipo di esecuzione:

Indipendentemente dal tipo di esecuzione, un punto di acquisizione dati o di lettura

consiste in tre fasi:

1. Eccitazione – Lo strumento StepOne™ illumina tutti i pozzetti della piastra di

reazione all'interno dello strumento StepOne, eccitando i fluorofori in ogni

reazione.

2. Emissione – L'ottica dello strumento StepOne focalizza la fluorescenza residua

emessa dai pozzetti della piastra di reazione. L'immagine risultante acquisita dal

dispositivo consiste unicamente nella luce che corrisponde al range delle

lunghezze d'onda di emissione.

3. Acquisizione – Lo strumento StepOne assembla una rappresentazione digitale

della fluorescenza residua acquisita durante un intervallo dalla durata fissa. Il

software StepOne™ memorizza l'immagine fluorescente non elaborata per

l'analisi.

Tipo di esecuzione Punto di acquisizione dati

Sessioni di

analisi in

tempo reale

Curva standard Lo strumento acquisisce dati dopo ogni fase di

estensione della PCR.

Curva standard

relativa

CT comparativo

(ΔΔCT)

Sessioni di

analisi end-

point

Genotipizzazione Lo strumento acquisisce dati prima e dopo la

PCR. Lo strumento può inoltre acquisire dati

durante la sessione di analisi (in tempo reale);

l'acquisizione di dati durante la sessione di

analisi è utile per la risoluzione di eventuali

problemi.

Presenza/assenza Lo strumento acquisisce dati prima e dopo la

PCR.

1-3Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Capitolo 1 Introduzione

Dopo una sessione di analisi, il software StepOne utilizza i dati di calibrazione

(spaziale, del fluorocromo e di background) per determinare la posizione e l'intensità

dei segnali fluorescenti in ogni lettura, il fluorocromo associato a ogni segnale

fluorescente e il significato del segnale.

Materiali di

consumo

supportati

Il sistema StepOne supporta i materiali di consumo elencati qui di seguito. È

possibile utilizzare tali materiali di consumo sia con i reagenti/protocolli standard sia

con quelli veloci.

Materiale di consumo Numero di

catalogo

•MicroAmp

™ Fast Optical 48-Well Reaction Plates

•MicroAmp

™ Optical 48-Well Adhesive Film

• 4375816

• 4375323

•MicroAmp

™ Fast 8-Tube Strips

•MicroAmp

™ Optical 8-Cap Strips

• 4358293

• 4323032

•MicroAmp

® Fast Reaction Tubes with Caps • 4358297

•MicroAmp

™ Fast 48-Well Trays

•MicroAmp

™ 48-Well Base Adaptor

•MicroAmp

™ Splash Free 96-Well Base

• 4375282

• 4375284

• 4312063

G

A

C

D

A

C

F

B

C

# Materiale di consumo

AMicroAmp

™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate

BMicroAmp

™ Fast 48-Well Tray

CMicroAmp

™ Splash Free 96-Well Base

DMicroAmp

™ Optical 8-Cap Strip

EMicroAmp

™ Fast 8-Tube Strip

FMicroAmp

® Fast Reaction Tubes with Caps

GMicroAmp

™ Optical 48-Well Adhesive Film

E

B

1-4 Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Capitolo 1 Introduzione

Per ulteriori

informazioni

Per ulteriori informazioni sugli argomenti trattati in questa guida, accedere alla voce

Help (Guida) nel software del sistema Real-Time PCR StepOne™ Applied

Biosystems premendo F1, facendo clic su nella barra degli strumenti oppure

selezionando Help (Guida)StepOne Help (Guida StepOne).

Preparazione degli esperimenti sul sistema StepOne™

Flusso di lavoro

generale

Prima dell'esecuzione degli esperimenti sul sistema StepOne, eseguire la

preparazione degli esperimenti come segue:

1. Selezionare un tipo di esperimento (pagina 1-5).

2. Selezionare il tipo di reagente (pagina 1-6).

3. Selezionare il tipo di saggio (pagina 1-7).

Informazioni

contenute nella

guida:

Questo capitolo fonisce informazioni generali sui tipi di esperimento, i tipi di

reagente e i tipi di saggio che è possibile utilizzare con il sistema StepOne.

I capitoli seguenti forniscono informazioni specifiche:

Capitolo Descrizione

Capitolo 2, Descrizione generale

dei reagenti • Descrive e compara i reagenti TaqMan® e

SYBR®Green.

• Fornisce informazioni sulla riduzione al minimo

della contaminazione di DNA.

Capitolo 3, Esperimenti di

quantificazione • Spiega la modalità di funzionamento del tipo di

esperimento.

• Fornisce un flusso di lavoro specifico per il tipo di

esperimento.

• Fornisce le linee guida per il disegno per ogni tipo

di saggio.

Capitolo 4, Esperimenti di

genotipizzazione

Capitolo 5, Esperimenti di

presenza/assenza

1-5Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Capitolo 1 Introduzione

Selezione del tipo di esperimento

È possibile eseguire i seguenti tipi di esperimento sul sistema StepOne:

• Quantificazione, inclusi:

–Curva standard

– Curva standard relativa

–C

T comparativo (ΔΔCT)

• Genotipizzazione

• Presenza/assenza

Nota: Sul sistema StepOne è inoltre possible eseguire l'analisi della curva di melting.

Esperimenti end-

point rispetto a

quelli in tempo

reale

È possibile categorizzare i tre tipi di esperimento in esperimenti in tempo reale e end-

point, come descritto qui di seguito.

Categoria Proprietà Tipo di

esperimento

Tempo reale • Lo strumento monitora gli sviluppi della PCR

durante il suo svolgimento.‡

• I dati vengono acquisiti durante lo sviluppo

della PCR.

• Le reazioni sono caratterizzate dal punto

temporale durante la fase ciclica in cui

l'amplificazione di un target viene rilevata la

prima volta.§

‡ Kwok and Higuchi, 1989.

§Saiki et al., 1985.

Quantificazione

End-point • I dati vengono acquisiti al termine del

processo PCR.

• Le reazioni sono caratterizzate dalla quantità

del target accumulata al termine della PCR.§

• Il datapoint rappresenta l'intensità

normalizzata del fluorocromo reporter oppure

dell'Rn.

Nota: È possibile che alcuni esperimenti end-

point includano datapoint pre-PCR. In caso

affermativo, il sistema calcola il valore del delta

Rn (ΔRn) attraverso la formula seguente:

Rn post-PCR – Rn pre-PCR = ΔRn

Genotipizzazione

Presenza/assenza

1-6 Guida reagenti del sistema Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

RISERVATO - Esclusivamente per uso interno AB. Non distribuire.

Capitolo 1 Introduzione

Selezione del tipo di reagente

È possibile utilizzare i seguenti tipi di reagenti (chimiche) sul sistema Step One:

• Reagenti TaqMan®

• Reagenti SYBR® Green

• Altri reagenti fluorescenti

Reagenti TaqMan I reagenti TaqMan includono i saggi TaqMan® (miscele pre-formulate contenenti i

set di sonde e primers) e le Master Mix TaqMan®. È possibile utilizzare i reagenti

TaqMan per i seguenti tipi di esperimento:

• Quantificazione, inclusi:

–Curva standard

– Curva standard relativa

–C

T comparativo (ΔΔCT)

• Genotipizzazione

• Presenza/assenza

IMPORTANTE! Applied Biosystems non consiglia l'uso del fluorocromo TAMRA™

come reporter o quencher con il sistema StepOne.

Reagenti SYBR

Green

I reagenti SYBR Green includono primer e Master Mix contenenti il fluorocromo

SYBR® Green. È possibile utilizzare i reagenti SYBR Green per gli esperimenti di

quantificazione:

• Curva standard

• Curva standard relativa

•C

T comparativo (ΔΔCT)

Nota: Non è possibile eseguire PCR multiplex utilizzando reagenti SYBR Green.

Per ulteriori informazioni, vedere “Selezione PCR singleplex o multiplex” a

pagina 3-10.

Altri reagenti È possibile utilizzare altri reagenti fluorescenti sul sistema StepOne, ma:

• Il software StepOne calcola automaticamente i volumi di reazione per i reagenti

TaqMan e SYBR Green, ma non fa altrettanto per gli altri reagenti.

• È necessario disegnare il proprio esperimento utilizzando il flusso di lavoro

dell'impostazione avanzata invece del flusso di lavoro del Design Wizard.

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Thermo Fisher Scientific Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Manuale del proprietario

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