02/2008, versione 1.0 2.1
Pipettamento 2
Concetto di "batch"
Il sistema cobas s 201 è progettato per l'analisi dei campioni in batch. Il
batch è un insieme di campioni e controlli che vengono pipettati, estratti,
amplificati e rivelati contemporaneamente, in base alle specifiche tecniche
previste dalle regole del test associato.
Un batch è composto da tutti i campioni e i controlli presenti in un
rack SK24.
Dalla creazione del pool alla generazione dei risultati, il batch è sempre
rintracciabile grazie all'ID del rack SK24 e all'ID univoco assegnato al
batch stesso in fase di pipettamento.
I campioni e i controlli nel batch sono rintracciabili perché il loro codice a
barre acquisito con il lettore corrisponde al codice a barre stampato sui
clip che contengono le provette campione (creazione del pool e
preparazione dei campioni) e le provette K (amplificazione e rivelazione).
Figura 2.1
Batch
ID rack SK24
Clip con codice a barre
univoco per provetta campione
2.2 02/2008, versione 1.0
Controlli RMEC (Roche-Manufactured External
Controls)
Ogni batch prevede l'uso dei controlli esterni prodotti da Roche (controlli
RMEC). Il numero di controlli RMEC necessari varia da test a test.
Nei test MPX vengono ricercati cinque analiti. Per ogni batch devono
essere pipettati cinque controlli RMEC positivi più un controllo RMEC
negativo. Durante il pipettamento, un'aliquota del controllo negativo
viene trasferita nella provetta campione, nella posizione 19 di ciascun rack
SK24. Successivamente le aliquote di ciascun controllo positivo vengono
trasferite nelle provette campione, nelle posizioni comprese tra la 20 e la
24 di ciascun rack SK24 (Figura 2.2).
I controlli RMEC vengono sempre pipettati prima dei campioni per
consentire all'operatore di correggere eventuali errori di dispensazione
dei controlli prima di iniziare a dispensare i campioni.
I controlli RMEC vengono sempre collocati nelle ultime posizioni
dei rack SK24: in questo modo i campioni di controllo assicurano il
monitoraggio dell'intero processo di analisi, dall'estrazione dei
campioni all'amplificazione e alla rivelazione.
Figura 2.2
Controlli RMEC in un rack SK24 per il test MPX
Controllo negativo
Controlli positivi
Pipettamento
02/2008, versione 1.0 2.3
Controlli UDEC (User-Defined External
Controls)
Il sistema cobas s 201 consente di assegnare a ogni test un massimo di
cinque controlli esterni definiti dall'utente (controlli UDEC). Il
responsabile del laboratorio definisce i requisiti dei controlli UDEC: nome
del controllo, schema del codice a barre, numero di lotto, data di scadenza
e posizione del campione di controllo UDEC nel rack SK24.
Dopo avere assegnato i controlli UDEC a un determinato test, l'operatore
può decidere se includerli o meno in una seduta di analisi.
Se sono inclusi, i controlli UDEC vengono pipettati sempre nel
primo rack SK24.
I controlli UDEC sono identificati nelle schermate e nei report delle
applicazioni Roche PDM Pooling Manager e Roche PDM Data Manager.
2.4 02/2008, versione 1.0
Piastre a pozzetti profondi
Le piastre a pozzetti profondi impiegate come piastre di archiviazione e
piastre intermedie durante il pipettamento dei pool primari sono
perfettamente identiche (Figura 2.3).
Ogni piastra a pozzetti profondi è dotata di un'etichetta con codice
a barre univoco.
Piastra di archiviazione
Durante la creazione dei pool primari è possibile preparare una piastra di
archiviazione in cui conservare un'aliquota di ogni provetta donatore per
l'eventuale pooling secondario.
Il pooling secondario può essere eseguito usando direttamente le
provette donatori, se non è stata predisposta una piastra di
archiviazione o se un pozzetto della piastra è inutilizzabile.
L'uso delle piastre di archiviazione è opzionale e può essere
configurato in fase di installazione.
Il pozzetto occupato dal campione all'interno della piastra di
archiviazione dipende dal numero di campioni inclusi nella seduta
e dal tipo di pooling che viene eseguito.
Piastra intermedia
La piastra intermedia è necessaria per il pipettamento dei grandi pool
primari. Nella piastra intermedia trovano provvisoriamente posto i pool
costituiti da 12 campioni che verranno successivamente uniti per formare
un grande pool primario.
Nel paragrafo che segue verranno fornite informazioni dettagliate
sul pipettamento dei grandi pool primari.
Figura 2.3
Piastra di archiviazione e piastra intermedia
Pipettamento
02/2008, versione 1.0 2.5
Pool primari
Un grande pool primario è un pool di campioni misti (
n
= 24, 48 o 96
campioni donatori) creato per un test iniziale.
Il pipettamento dei pool primari è un processo a due fasi costituito da 1)
una seduta da piastra e 2) una seduta in batch. Ognuna è una seduta
distinta, che prevede un'operazione di pipettamento.
Seduta da piastra
Nel corso di una seduta da piastra, le aliquote provenienti da gruppi di
campioni donatori vengono combinate nei pozzetti di una piastra
intermedia in modo da creare pool provvisori di 12
campioni
.
Il numero di campioni donatori caricati deve essere un multiplo delle
dimensioni finali del pool (ovvero 24, 48 o 96). Il numero massimo di
campioni donatori che è possibile pipettare dipende dal tipo di pipettatore
in uso:
• Il pipettatore Hamilton Microlab STAR IVD consente di pipettare
fino a 864 campioni donatori.
• Il pipettatore Hamilton Microlab STARlet IVD consente di
pipettare fino a 384 campioni donatori.
Di seguito vengono riassunte le fasi del pipettamento di una seduta da
piastra per un pool di 96 campioni. Il pipettamento di pool costituiti da 24
o 48 campioni avviene in modo analogo.
• Dal primo gruppo di provette donatori viene aspirato 1 ml di ogni
campione, che successivamente viene trasferito nella piastra di
archiviazione. La stessa procedura viene ripetuta aspirando dalle
stesse provette donatori aliquote di 700 µl, per un totale di 1,7 ml di
ogni campione donatore trasferiti nei corrispondenti pozzetti della
piastra di archiviazione (Figura 2.4).
• Dai pozzetti della piastra di archiviazione vengono quindi aspirate
aliquote di 135 µl, subito trasferite nei pozzetti della piastra
intermedia usata per conservare i pool provvisori (Figura 2.4).
Se non viene predisposta una piastra di archiviazione, le aliquote
da 135 µl sono pipettate direttamente dalle provette donatori alla
piastra intermedia.
2.6 02/2008, versione 1.0
• La procedura viene quindi ripetuta per il gruppo di campioni
donatori successivo. Nei successivi pozzetti della piastra di
archiviazione vengono trasferiti 1,7 ml di ogni campione donatore
appartenente al gruppo. Da ogni pozzetto vengono quindi aspirati
135 µl di campione, successivamente trasferiti nella stessa colonna
dei pozzetti della piastra intermedia in cui si trovano i campioni
donatori appartenenti al primo gruppo (Figura 2.5).
• La procedura va avanti fino a quando tutti i campioni donatori
inclusi nel primo grande pool primario saranno stati pipettati e
tutti i pozzetti nella prima colonna della piastra intermedia
conterranno le aliquote di dodici campioni donatori.
• Quindi l'intera procedura dovrà essere ripetuta per creare i pool
provvisori per ogni pool primario aggiuntivo, usando gli altri
pozzetti della piastra intermedia per i nuovi pool provvisori.
Al termine della seduta, le piastre di archiviazione conterranno
un'aliquota di 1,565 ml da ognuna delle provette donatori, mentre i
pozzetti della piastra intermedia usati conterranno ognuno un'aliquota di
135 µl dalle dodici provette donatori.
Figura 2.4
Pipettamento del primo gruppo di campioni donatori durante una seduta da piastra
(esempio di seduta da piastra con un pool primario di 96 campioni)
Piastra di archiviazione
Piastra intermedia
Rack per provette donatori con 32 posizioni
1 ml +700 µl
135 µl
Posizione 1
Posizione 32
Figura 2.5
Pipettamento del successivo gruppo di campioni donatori durante una seduta da piastra
(esempio di seduta da piastra con un pool primario di 96 campioni)
Piastra di archiviazione
Piastra intermedia
Rack per provette donatori con 32 posizioni
1 ml +700 µl
135 µl
Posizione 1
Posizione 32
Pipettamento
02/2008, versione 1.0 2.7
Seduta in batch
Nel corso di una seduta in batch, le aliquote dei campioni vengono
pipettate dai pozzetti della piastra intermedia e trasferite nelle provette
campione per creare un grande pool primario (Figura 2.6):
• Per un pool primario di 24, da due pozzetti vengono pipettate
aliquote di 500 µl, poi trasferite in una provetta campione.
• Per un pool primario di 48, da quattro pozzetti vengono pipettate
aliquote di 250 µl, poi trasferite in una provetta campione.
• Per un pool primario di 96, da otto pozzetti vengono pipettate
aliquote di 125 µl, poi trasferite in una provetta campione.
È possibile caricare le piastre intermedie per più di una seduta da piastra.
Il numero massimo di piastre intermedie che è possibile pipettare dipende
dal tipo di pipettatore in uso:
• Il pipettatore Hamilton Microlab STAR IVD consente di pipettare
fino a 5 piastre intermedie.
• Il pipettatore Hamilton Microlab STARlet IVD consente di
pipettare fino a 4 piastre intermedie.
Figura 2.6
Pipettamento di due pool di 96 campioni durante una seduta in batch
Piastra intermedia
125 µl
2.8 02/2008, versione 1.0
Seduta in batch ripetuta
Una seduta in batch ripetuta
consente di creare un altro grande pool
primario per sostituirne uno che ha generato un
risultato del test non
valido
.
Per la seduta in batch ripetuta viene usata la piastra intermedia che
è stata creata nella prima fase (seduta da piastra) del pooling primario
originale.
Il pipettamento per la seduta in batch ripetuta deve avvenire dalla
piastra intermedia. Se uno dei pozzetti della piastra intermedia non
è disponibile, viene programmato un pool di risoluzione per i
campioni interessati.
Caricare una sola piastra intermedia per eseguire una seduta in
batch ripetuta.
Nel corso di una seduta in batch ripetuta, le aliquote vengono pipettate
dagli stessi pozzetti della piastra intermedia che sono stati usati per creare
il grande pool primario originale (Figura 2.6) alle provette campione, in
modo da creare il pool primario sostitutivo (Figura 2.7).
Figura 2.7
Seduta in batch ripetuta per un pool primario di 48 campioni
Piastra intermedia
250 µl
Pipettamento
02/2008, versione 1.0 2.9
Pooling 2D
Il Pooling 2D (pooling bidimensionale) consente di analizzare
nuovamente i campioni dei grandi pool primari che hanno generato
risultati reattivi. Nel corso del pooling 2D, ogni campione viene pipettato
in due diversi pool in base ad una distribuzione (Figura 2.8) che garantisce
l'identificazione dei campioni non reattivi dopo una singola seduta.
Durante una seduta di pooling 2D è possibile analizzare i campioni
di un pool primario.
Il numero di pool 2D che vengono creati dipende dalle dimensioni del
grande pool primario reattivo:
Figura 2.8
Distribuzione dei campioni nei pool 2D
(esempio di pooling 2D con un pool primario di 48 campioni)
Piastra di archiviazione
P
ool primario 2
Pool primario 1
Pool di sei campioni
Posizioni 1-8 delle provette campione
Pool di otto campioni
Posizioni 9-14 delle provette campione
Dimensioni
pool
Numero di pool 2D Aliquota di ogni campione
24 4 pool di 6 campioni
6 pool di 4 campioni
167 µl
250 µl
48 8 pool di 6 campioni
6 pool di 8 campioni
167 µl
125 µl
96 Due batch, ciascuno
contenente:
8 pool di 6 campioni
6 pool di 8 campioni
167 µl
125 µl
2.10 02/2008, versione 1.0
Di seguito vengono riassunte le fasi del pipettamento di una seduta di
pooling 2D per un pool di 48 campioni. Il pipettamento di pool costituiti
da 24 o 96 campioni in una seduta di pooling 2D avviene in modo analogo.
Se non è disponibile una piastra di archiviazione, se uno dei
pozzetti della piastra di archiviazione non è valido o contiene un
volume di campione insufficiente, è possibile pipettare le aliquote
direttamente dalle provette donatori.
• Aliquote di 167 µl dei campioni dei donatori vengono aspirate da
quattro pozzetti nella prima colonna della piastra di archiviazione e
dispensate in quattro provette campione, partendo dalla posizione
1 del rack SK24 (Figura 2.9).
• Ulteriori aliquote di 125 µl dei campioni dei donatori vengono
successivamente aspirate dagli stessi quattro pozzetti della piastra
di archiviazione e quindi dispensate in una singola provetta
campione nella posizione 9 del rack SK24.
• Aliquote di 167 µl di campioni dei donatori vengono quindi
aspirate da quattro pozzetti nella colonna successiva della piastra di
archiviazione e dispensate in quattro provette campione, partendo
dalla posizione 5 del rack SK24.
• Ulteriori aliquote di 125 µl dei campioni dei donatori vengono
successivamente aspirate dagli stessi quattro pozzetti della piastra
di archiviazione e quindi dispensate in una singola provetta
campione nella posizione 9 del rack SK24.
A questo punto le provette campione nelle posizioni comprese tra
la 1 e la 8 del rack SK24 contengono ciascuna un'aliquota di un
singolo campione, mentre la provetta nella posizione 9 contiene le
aliquote di otto campioni (Figura 2.9).
Figura 2.9
Pipettamento dai primi otto pozzetti
(esempio di pooling 2D con un pool primario di 48 campioni)
Piastra di archiviazione
Posizione 9
167 µl
125 µl
Pipettamento
02/2008, versione 1.0 2.11
• La procedura viene quindi ripetuta per i successivi otto pozzetti
della piastra di archiviazione. Aliquote di 167 µl dei campioni dei
donatori vengono dispensate nuovamente nelle provette campione
che occupano le posizioni tra la 1 e la 8 del rack SK24, mentre
aliquote di 125 µl dei campioni del donatori vengono dispensate in
una singola provetta campione nella posizione 10 del rack SK24
(Figura 2.10).
• La procedura va avanti fino a quando tutti i campioni donatori
saranno stati pipettati.
Al termine della seduta, le provette campione nelle posizioni
comprese tra la 1 e la 8 del rack SK24 contengono ciascuna le
aliquote di sei campioni dei donatori, mentre le provette campione
nelle posizioni comprese tra la 9 e la 14 contengono ciascuna le
aliquote di otto campioni donatori.
Figura 2.10
Pipettamento dai successivi otto pozzetti
(esempio di pooling 2D con un pool primario di 48 campioni)
Piastra di archiviazione
Rack SK24
167 µl
125 µl
2.12 02/2008, versione 1.0
Pooling di conferma
Il Pooling di conferma consente di analizzare nuovamente i campioni di
grandi pool primari che hanno generato un risultato reattivo qualora vi
sia ragione di ritenere che almeno uno dei campioni del pool primario sia
reattivo (ad esempio, positività ad un test sierologico).
Il pooling di conferma è spesso usato anche per analizzare
nuovamente i pool ridotti.
I campioni sospettati di reattività devono essere pipettati in pool singoli,
mentre i campioni non sospetti possono confluire in pool misti (Figura 2.11).
Durante una seduta di pooling di conferma è possibile analizzare i
campioni di un pool primario.
Da un pool primario di 48 o 96 è possibile selezionare un massimo
di quattro campioni da pipettare in pool con campione singolo. Da
un pool primario di 24 è possibile selezionare un massimo di due
campioni da pipettare in pool con campione singolo.
I pool con campioni misti possono essere costituiti da 12, 11, 6 o 4
campioni, in base alle seguenti condizioni: 1) numero di campioni nel
pool primario e 2) numero di campioni donatori selezionati per il test
individuale. Di seguito sono riportati i volumi dei campioni che vengono
aspirati in base alle dimensioni dei pool misti:
Figura 2.11
Distribuzione dei campioni nei pool di conferma
(esempio di pooling di conferma con un pool primario di 48 campioni)
Piastra di archiviazione
Pool primario 2
Pool primario 1
Pool misti
Posizioni 1-4 delle provette campione
Pool con campione singolo
Posizioni 5-8 delle
provette campione
Dimensione pool misto Aliquota di ogni campione
12 campioni 92 µl
11 campioni 92 µl
6 campioni 167 µl
4 campioni 250 µl
Pipettamento
02/2008, versione 1.0 2.13
Di seguito vengono riassunte le fasi del pipettamento per un pool
di conferma:
Se non è disponibile una piastra di archiviazione, se uno dei
pozzetti della piastra di archiviazione non è valido o contiene un
volume di campione insufficiente, è possibile pipettare le aliquote
direttamente dalle provette donatori.
• Dal primo gruppo di pozzetti della piastra di archiviazione
vengono aspirate le aliquote (92 µl, 167 µl o 250 µl) dei campioni
donatori che si presume non reattivi. Dopo ogni aspirazione, le
aliquote dei campioni vengono trasferite in una provetta campione
a partire dalla posizione 1 di un rack SK24.
• La procedura viene ripetuta saltando i pozzetti (o le provette) dei
campioni donatori che potrebbero essere reattivi (Figura 2.12).
Figura 2.12
Pipettamento per i pool di conferma che si presume non reattivi
(esempio di pooling di conferma con un pool primario di 48 campioni)
Piastra di archiviazione
Rack SK24
92 µl
2.14 02/2008, versione 1.0
• Dopo che tutte le aliquote dei campioni dei donatori che si
presume non reattivi sono state pipettate, vengono aspirate
aliquote di 1 ml dai pozzetti (o dalle provette) dei campioni
donatori che si presume reattivi, le quali vengono poi trasferite in
provette campione singole (Figura 2.13).
Figura 2.13
Pipettamento per i pool singoli che si presume reattivi
(esempio di pooling di conferma con un pool primario di 48 campioni)
Piastra di archiviazione
Rack SK24
1 ml
Pipettamento
02/2008, versione 1.0 2.15
Pooling di risoluzione
Il pool di risoluzione è un pool costituito da un unico campione, che
viene creato per i campioni 1) interessati da errori di pipettamento
durante la seduta di pooling primario o 2) contenuti in un pool di
conferma reattivo o un pool 2D reattivo. Per preparare un pool di
risoluzione occorre pipettare un'aliquota da un pozzetto della piastra di
archiviazione a una provetta campione.
Il responsabile del laboratorio può anche decidere di usare un pool
di risoluzione per risolvere risultati non validi.
È possibile aspirare il campione dalla provetta donatore se non è
disponibile una piastra di archiviazione o se il pozzetto della piastra
di archiviazione che contiene il campione del donatore desiderato è
inutilizzabile.
Durante una seduta di pooling di risoluzione è possibile analizzare
un massimo di 36 campioni.
Durante il pooling di risoluzione, viene trasferito 1 ml di campione dal
pozzetto nella piastra di archiviazione a una provetta campione singola.
Figura 2.14
Pipettamento dei pool di risoluzione
Piastra di archiviazione
Rack SK24
1 ml
Pozzetti selezionati per
il pool di risoluzione
2.16 02/2008, versione 1.0
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